6种天然药物对人眼晶状体上皮细胞增殖及迁移抑制作用的比较*

段朝野， 赵心悦， 卞晨阳， 王 智

华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科，武汉 430022



6种天然药物对人眼晶状体上皮细胞增殖及迁移抑制作用的比较*

段朝野， 赵心悦△， 卞晨阳， 王 智

华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科，武汉 430022

目的 观察白藜芦醇(Resveratrol)、叶黄素(Lutein)、苦参碱(Matrine)、原花青素(Proanthocyanidin)、姜黄素(Curcumin)、β-榄香烯(β-Elemene)抑制人晶状体上皮细胞(SRA01/04)增殖和迁移的作用，并比较它们抑制该细胞增殖及迁移作用的强弱。方法 采用CCK-8法及划痕实验初步定量分析比较各药物对SRA01/04细胞增殖和迁移的影响。结果 通过CCK-8实验证实，6种天然药物均可显著抑制bFGF诱导的SRA01/04的增殖(均P<0.05)，且6种药物抑制bFGF诱导的细胞增殖作用由强到弱依次为：姜黄素、β-榄香烯、苦参碱、叶黄素、原花青素、白藜芦醇(P<0.05)。通过细胞划痕实验发现，6种天然药物均可抑制SRA01/04的迁移(均P<0.05)，且抑制细胞迁移作用由强到弱依次是：苦参碱、β-榄香烯、姜黄素、白藜芦醇和叶黄素、原花青素(P<0.05)，其中白藜芦醇与叶黄素的作用强度相近(P>0.05)。结论 天然药物白藜芦醇、叶黄素、苦参碱、原花青素、姜黄素、β-榄香烯可有效地抑制由bFGF诱导的SRA01/04增殖，并且可抑制该细胞的水平迁移。其中姜黄素和苦参碱分别在抑制SRA01/04增殖及迁移中作用较为突出，可对防治后发性白内障药物的研发提供一定的实验参考。

姜黄素； 苦参碱； 人晶状体上皮细胞； 后发性白内障； 细胞增殖； 细胞迁移

白内障(cataract)是目前使数以百万计人致盲的眼病，其主要治疗方法为手术治疗，从古时的“金针拨障术”到现在的“超声乳化”以及飞秒激光技术的应用，治疗效果有了质的飞跃，但术后并发症仍然困扰着广大眼科临床医生。后发性白内障(after-cataract)简称后发障，是目前白内障术后常见且较棘手的并发症，白内障患者术后的视力恢复直接受其影响[1]。

相关研究已证实后发障的发生主要是因为术后晶状体上皮细胞残留在眼内，失去了晶状体皮质对其的压力，发生增殖、迁移和化生，生成新的晶状体物质或导致后囊膜皱缩而混浊[2-3]。此外，晶状体上皮细胞自身可产生并释放多种增殖性细胞因子，它们不同程度地参与细胞的增殖过程[4]。

目前治疗后发障主要采用激光后囊切开术，该方法可在一定程度上解决问题，但同时也存在多种并发症的可能。药物防治方面，大多数药物在抑制晶状体上皮细胞增殖、迁移的同时对眼内其他组织有不同程度的伤害。动物、植物、矿物等自然界中存在的有药理活性的天然药物毒副作用较低，可为防治后发障药物的开发提供新思路。本研究选取白藜芦醇、叶黄素、苦参碱、原花青素、姜黄素、β-榄香烯等6种天然药物，通过CCK-8实验及细胞划痕实验比较它们对人晶状体上皮细胞SRA01/04增殖及迁移的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及试剂

人晶状体上皮细胞系(SRA01/04)购自上海北诺生物科技有限公司，胎牛血清购于美国Gibco公司。姜黄素(纯度≥99%)，原花青素(纯度≥98%)，苦参碱(纯度≥98%)，白藜芦醇(纯度≥98%)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。叶黄素(纯度≥98%)购自上海北诺生物科技有限公司。β-榄香烯(纯度99.2%)购自中国药品生物制品检定所。DMEM高糖培养液，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)，PBS及青霉素链霉素溶液购自美国Hyclone公司。DMSO购自美国Sigma公司。bFGF购自上海北诺生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购自日本DOJINDO公司。

1.2 仪器

超低温冰箱(美国Thermo公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，CO2细胞培养箱(美国Nuaire公司)，倒置显微镜及成像系统(日本Olympus公司)，台式低温离心机(德国Eppendorf公司)，多功能酶标仪(美国EnSpire公司)，电子分析天平(德国Mettler Toledo)。

1.3 SRA01/04的培养

取DMEM高糖培养液，加入胎牛血清及青霉素链霉素溶液(二者最终浓度分别为10%和1%)，配置成完全培养液用于培养细胞。将细胞放入37℃、含5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。

1.4 CCK-8实验检测细胞增殖情况

使用DMSO将6种药物充分溶解后避光保存于4℃冰箱备用，实验前，使用含10%血清和10 μg/L的bFGF的细胞培养液将药物溶液稀释为：白藜芦醇200 mg/L，叶黄素48 mg/L，姜黄素30 mg/L，苦参碱1.5 g/L，原花青素100 mg/L，β-榄香烯160 mg/L(DMSO浓度<0.1%)。取对数生长期、状态良好的细胞以5×104/mL的密度种板，每孔100 μL，并分为空白组(常规培养)，增殖组(加用10 μg/L的bFGF)，药物组(6组，在增殖组培养条件的基础上使用不同药物进行干预)。每组包含6个平行孔，随后按照试剂盒说明操作并测定每组吸光度(A)值。

1.5 划痕实验测定不同处理组细胞迁移情况

用无血清培养液稀释各药物溶液(最终浓度同1.4项)。将对数期、状态良好的细胞，接种于6孔板，并分为空白组(无血清培养液培养)和药物组(6组，在空白组培养条件的基础上分别使用不同药物进行干预)。细胞融合度至90%时全部改为无血清培养液，同步化24 h，随后进行划痕，并于划痕后0 h和24 h分别取同一视野进行拍照。使用Image-Pro Plus 5.0软件对拍摄图片中划痕的区域面积进行测量并计算迁移率，进行初步定量分析。计算公式：

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 不同药物对细胞增殖情况的影响

增殖组A值显著高于空白组(P<0.05)，可知10 μg/L的bFGF能诱导、增强SRA01/04的增殖；各药物组A值均低于增殖组(P<0.05)，表明各药物均可抑制SRA01/04增殖；各药物抑制细胞增殖效果不同(P<0.05)，且相邻秩次组差异有统计学意义(P<0.05)，抑制细胞增殖作用由强到弱依次为：姜黄素、β-榄香烯、苦参碱、叶黄素、原花青素、白藜芦醇。结果见表1、图1。

2.2 划痕实验测定不同处理组细胞迁移情况

划痕后的细胞在24 h内发生不同程度的迁移，各药物组细胞迁移率均低于空白组(P<0.05)，说明各药物均可抑制SRA01/04的迁移；各药物抑制SRA01/04细胞迁移的能力不同(P<0.05)，其中除白藜芦醇与叶黄素外(均P>0.05)，其余相邻秩次药物组间差异均有统计学意义(均P<0.05)，抑制细胞迁移能力由强到弱为：苦参碱、β-榄香烯、姜黄素、白藜芦醇与叶黄素、原花青素。结果见表2、图2。

组别A值白藜芦醇0 181±0 006叶黄素0 134±0 005苦参碱0 128±0 004原花青素0 169±0 005姜黄素0 094±0 008β⁃榄香烯0 115±0 004增殖组0 326±0 009空白组0 195±0 003

1:白藜芦醇；2：叶黄素；3：苦参碱；4：原花青素；5：姜黄素；6：β-榄香烯；7：增殖组；8：空白组;与空白组比较，*P<0.05；与增殖组比较，#P<0.05

组别迁移率(%)白藜芦醇51 35±1 00叶黄素55 55±1 70姜黄素45 80±0 50苦参碱31 56±0 90原花青素94 64±1 30β⁃榄香烯37 00±0 30空白组100 00±1 90

1:白藜芦醇；2：叶黄素；3：苦参碱；4：原花青素；5：姜黄素；6：β-榄香烯；7：空白组；与空白组比较，*P<0.05

3 讨论

白内障手术可启动眼内的损伤-修复反应，产生多种细胞生长因子。其中，bFGF(FGF-2)的基本作用是增强细胞有丝分裂活性，促进细胞增殖和分化。本实验证实10 μg/L的bFGF对SRA01/04具有明确的诱导增殖的作用。

白藜芦醇(C14H12O3)主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物中，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用[5]。研究表明它可通过抑制RNA还原酶或DNA聚合酶的活性，或通过减少多种细胞因子合成及分泌，减轻炎症反应[6-7]，从而抑制细胞的增殖。有学者认为白藜芦醇能通过降低nuclear factor-kappaB(NF-κB)的活性，抑制基质金属蛋白酶(MMPs)，降低肿瘤细胞的侵袭能力[8]。同时Kawashima等[9]发现，白内障术后晶状体后囊可有MMP-1、MMP-2及MMP-9表达，认为MMPs可能与调节晶状体上皮细胞功能及白内障的发病有关。因此我们猜测白藜芦醇也可通过此途径发挥作用。

叶黄素(C40H56O2)属于类胡萝卜素家族，广泛存在于绿叶植物中，在抑制肿瘤细胞生长、预防心血管疾病等方面有肯定作用[10]。曾有报道认为叶黄素可通过阻滞细胞周期，或调节Bax和Bcl-2蛋白的表达或抑制脂肪氧合酶活性从而抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、降低肿瘤侵袭作用[11-12]。

姜黄素(C21H20O6)主要来源于姜黄、郁金、莪术、菖蒲等，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多方面药理作用[13]。黄秀榕等[14]以牛晶状体上皮细胞作为研究对象，证明姜黄素通过减少晶状体上皮细胞核内DNA含量和使细胞质内线粒体跨膜电位(ΔΨm)下降来诱导细胞凋亡，进而抑制细胞的增殖及迁移。徐哲等[15]发现姜黄素作用于SRA01/04细胞后胞内Caspase-3蛋白的表达增多，推断姜黄素诱导细胞的凋亡与Caspase途径有关。

苦参碱(C15H24N2O)是从豆科植物苦参、苦豆子、山豆根中提取的生物碱，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等多方面的药理作用[13]。王智等[16]发现苦参碱可阻滞兔晶状体上皮细胞生长周期，进而抑制细胞增殖，并推测其具体机制可能与抑制细胞端粒酶活性有关。也有研究表明苦参碱抑制细胞增殖可能与Bax、Bcl-2等凋亡相关基因的表达有关[17]。PKA活性与细胞移动能力相关，文显梅等[18]发现苦参碱可降低HeLa细胞中PKA的活性，显著抑制细胞的迁移。

原花青素(C30H12O6)存在于葡萄籽、银杏叶、松树皮等植物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用[13]。有研究证实原花青素可激活Caspases途径，诱导人口腔癌细胞HSC-2的凋亡[19]。罗琰等[20]认为原花青素可能通过增加p21的表达导致牛晶状体上皮细胞的细胞周期受到阻滞，但具体机制有待于进一步的探索。

β-榄香烯(C15H24)主要存在于龙脑香树、郁金、人参等，是我国自主研发的抗肿瘤药物——榄香烯中的主要抗肿瘤成分[21]。研究表明，榄香烯可激活牛晶状体上皮细胞内核酸内切酶，促使DNA分解并抑制DNA合成，从而发挥抑制细胞增殖的作用[22]。

防治后发障需要解决的重要问题是抑制晶状体上皮细胞增殖和迁移，与肿瘤的治疗有一定相似性[23]。Power等[24]认为，防治后发障的药物在眼内应用应具备三个要素：①晶状体上皮细胞的增殖和迁移能够被其有效抑制；②药物给药方便，且能够维持一定的作用浓度和时间；③药物对眼内其它组织无毒副作用。在肯定药物作用的同时要考虑药物的安全性。毒副作用小一直是天然药物一个突出的优势，实验证明白藜芦醇属于无毒级物质，无致突变性[25]；长期给予大鼠叶黄素，未发现明显毒性反应[26]；苦参碱属低毒类物质；实验证实原花青素无毒副作用[27]；我国药典及相关研究认为姜黄素无毒副作用[28]；李莹等[29]使用榄香烯和5-FU进行结膜下注射，比较后发现榄香烯对局部无明显毒副作用。

本课题中姜黄素抑制细胞增殖的作用最强，苦参碱抑制细胞迁移作用最强。推测其原因可能是姜黄素可同时启动多条细胞凋亡途径；苦参可碱通过抑制cAMP/PKA/MLC、cAMP/PKA/ Rac1、cAMP/PKA/VASP等与PKA相关的途径抑制细胞迁移。

综上所述，认为姜黄素和苦参碱在抑制后发障发生、发展上较其他药物更为有效，可为后发障的防治提供实验参考，倘若配合以合适的给药途径，有望成为防治后发障的有效药物。

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(2015-07-02 收稿)

Comparison of Inhibitory Effects of Six Natural Medicines on Proliferation and Migration of Human Lens Epithelial Cells

Duan Chaoye，Zhao Xinyue△，Bian Chenyangetal

DepartmentofOphthalmology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

Objective To examine the inhibitory effects of six natural medicines (resveratrol，lutein，matrine，proanthocyanidin，curcumin，β-elemene) on the proliferation and migration of human lens epithelial cells and compare their inhibitory intensity.Methods Cell counting kit-8 (CCK-8) assay and scratch-wound assay were used to quantitatively analyze the effect of the medicines on the proliferation and migration of SRA01/04 cells.Results CCK-8 assay demonstrated that all the six natural medicines could significantly inhibit the bFGF-induced proliferation of SRA01/04 cells.The order of proliferation inhibition from strong to weak was curcumin>β-elemene>matrine>lutein>proanthocyanidin>resveratrol (P<0.05).Scratch-wound assay showed that all these medicines had the ability to inhibit the migration of SRA01/04 cells (P<0.05) and matrine had the strongest suppressive effect on cell migration，which was followed by β-elemene ，curcumin，resveratrol，lutein，and proanthocyanidin (P<0.05).The effect of resveratrol on cell migration was similar to that of lutein (P>0.05).Conclusion The six natural medicines can effectively inhibit the bFGF-induced proliferation of SRA01/04 cells and suppress their horizontal migration.The present study demonstrated the remarkable effects of curcumin and matrine on the proliferation and migration of human lens epithelial cells，providing the guidance for developing an effective medicine for prevention and treatment of after-cataract.

curcumin; matrine; human lens epithelial cells； after-cataract； cell proliferation； cell migration

*华中科技大学研究生创新创业基金资助项目(No.01-09-070121)

R776.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2015.05.009

段朝野，男，1987年生，硕士研究生，E-mail：272414684@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：531107255@qq.com