丹红注射液对脓毒症大鼠心肌组织氧自由基及HMGB1表达的影响

胡丹丹杨国良楼黎明

丹红注射液对脓毒症大鼠心肌组织氧自由基及HMGB1表达的影响

胡丹丹1杨国良2楼黎明1

目的 观察丹红注射液对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用，探讨其可能作用机制。方法24只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、丹红组，每组6只。盲肠结扎并穿孔（CLP）法建立脓毒症大鼠动物模型，观察各组心肌组织超微结构改变，心肌组织丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）和高迁移率族蛋白1（HMGB1）含量的变化。结果 CLP术后24h，与手术组比较，模型组、丹红组大鼠心肌组织MDA含量［（5.5706±1.3251）μ/mg prot、（3.9900±1.0559）μ/mg prot比（1.1506±0.1771）μ/mg prot］、HMGB1蛋白表达量（0.6074±0.0504、0.5010±0.1049比0.1427± 0.0345）升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而模型组、丹红组大鼠心肌组织SOD活力［（10.5276± 3.0568）nmol/mg prot、（15.5129±3.4425）nmol/mg prot比（20.5604±3.1312）nmol/mg prot］降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，丹红组大鼠心肌组织MDA含量表达降低［（3.9900±1.0559）μ/ mg prot比（5.5706±1.3251）μ/mg prot，P＜0.05］，SOD活力升高［（15.5129±3.4425）nmol/mg prot比（10.5276±3.0568）nmol/mg prot，P＜0.05］，心肌组织HMGB1表达量降低（0.5010±0.1049比0.6074± 0.0504，P＜0.05）；相同时间点心肌超微结构提示模型组大鼠心肌细胞线粒体肿胀，部分空泡变性；丹红组心肌细胞损伤轻于模型组。结论 丹红注射液对脓毒症大鼠心肌损伤有一定程度的保护作用，其作用机制可能与清除氧自由基，降低HMGB1含量有关。

大鼠；脓毒症；心肌损伤；氧自由基；HMGB1；丹红注射液

脓毒症是严重创伤、感染、休克等多种应激状态下的常见并发症，发病率高，死亡率高，心功能不全和心肌细胞损伤是脓毒性休克的严重表现之一，约有40%～50%的脓毒症患者会合并心脏功能不全。与脓毒症患者相比，合并心肌功能障碍的脓毒症患者的死亡率从20%升高到70%[1]。丹红注射液主要成分丹参、红花，功效活血化瘀，通脉舒络。既往主要用于冠心病、瘀血型肺心病等治疗，已证实其有改善微循环、抗氧自由基等作用，而对脓毒症心肌损伤是否有保护作用尚未报道。本研究以大鼠盲肠结扎并穿孔（CLP）法复制脓毒症动物模型，通过丹红注射液对脓毒症大鼠心肌组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）水平变化及对心肌组织超微结构的影响，评价丹红注射液对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用。

1 实验材料

1.1 动 物 雄性Wistar大鼠24只，清洁级，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供和饲养，许可证号：SYXK（浙）2013-0184。大鼠造模前在标准饲养条件下适应性喂养1周，术前24h机（Eppendorf Centrifuge 5804，德国）；紫外分光光度计（BECKMANDU-600，美国）；电泳转膜装置（BioRAD，美国）；TS-1型脱色摇床（江苏省海门市麒麟医用仪器厂）；数显恒温水浴锅（泰州市华普达教学仪器有限公司）；BioSenSC300凝胶图象分析系统（上海山富科学仪器有限公司）；等。

1.2 药 物 丹红注射液（规格：10mL/支，山东步长制药有限公司生产）；戊巴比妥钠（上海西塘生物科技有限公司）。

1.3 主要试剂 SOD试剂盒、MDA试剂盒（批号20090603，南京建成生物工程研究所）；Bradford蛋白质定量试剂盒（批号PA102，天根生化科技有限公司）；山羊抗HMGB1多克隆抗体（Santa，美国）；山羊抗β-actin多克隆抗体（Santa，美国）；辣根酶标记兔抗山羊二抗（上海麦约尔生物技术有限公司）；等。

2 实验方法

2.1 脓毒症模型制备 盲肠结扎穿孔术（CLP）法制备脓毒症模型：大鼠经2%戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉后，沿腹正中作一长1.5cm的切口，打开腹腔后小心分离盲肠，避免碰触肠系膜血管，在盲肠根部结扎，在与肠系膜相对的盲端肠壁浆膜面用9号针头穿刺2次，轻挤出少量内容物，还纳盲肠于腹腔，关闭腹腔，逐层缝合，术后即刻予以皮下注射生理盐水10mL/kg补充手术过程中丢失的体液。

2.2 分组及给药 24只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和丹红组，每组6只。正常组与其余各组同步饲养，麻醉后腹主动脉采血处死；假手术组麻醉后开腹翻动肠道，关腹，24h后麻醉，腹主动脉采血处死；模型组和丹红组行CLP，术后分别于术后0、6、12h尾静脉注射生理盐水5mL/kg或丹红注射液5mL/kg，于CLP术后24h麻醉并腹主动脉采血处死。

2.3 指标检测

2.3.1 心肌组织透射电镜样品制备及观察 迅速切取1mm3大小的心肌组织放入2.5%戊二醛固定液固定，电镜标本制备由上海中医药大学病理教研室完成，透射电子显微镜下观察心肌组织超微结构。

2.3.2 心肌组织匀浆蛋白含量测定 Bradford蛋白质定量试剂盒测定，严格按说明书操作。

2.3.3 心肌组织MDA含量测定 采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，严格按试剂盒按说明书操作。

2.3.4 心肌组织SOD含量测定 采用黄嘌呤氧化酶法测定，严格按试剂盒说明书操作。

2.3.5 心肌组织HMGB1蛋白含量检测 采用免疫印迹（Western Blot）法测定。具体步骤为：蛋白抽提，Bradford法测定蛋白含量；配制SDS-PAGE凝胶，将样品与2×SDS凝胶加样缓冲液以1：1混匀，每孔配制含80μg总蛋白样的样品液；上样前沸水煮10min，冰浴3min；将准备好的样品液和生物素标记的预染蛋白质分子量标准分别上样，预染蛋白质分子量标准加入第一个孔中；使用Bio-Rad电泳装置，样品首先在100V电压下电泳至染料接近分离胶顶端；然后120V电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部；依据胶的大小裁取膜和滤纸6片，放入Western转膜液中平衡10min左右；装配转移三明治：海绵、3层滤纸胶膜3层滤纸海绵，每层放好后，用试管平压赶去气泡；将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加入转膜液，插上电极，220mA，1.5h，期间保持恒电流；转膜结束后，切断电源，取出杂交膜；参照预染蛋白质分子量标准，根据目的蛋白与内参β-Actin位置的不同，将膜切割成两段并标记；用蒸馏水将膜漂洗干净；配制3%BSA溶液，膜在3%BSA溶液中室温摇床，封闭过夜；封闭后的膜用PBST洗膜3次，每次10min；加入一抗（目的蛋白抗体1：400，内参抗体1：2000），室温摇床2h，抗原抗体结合；PBST洗膜3次，每次10min。加入HRP标记的二抗以结合一抗，室温摇床1h；PBST洗膜3次，每次10min；化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育5min；去除过量的反应液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光；图片扫描保存为电脑文件，用分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化；目的蛋白的灰度值除以内参β-Actin的灰度值以校正误差，所得结果代表样品的蛋白相对含量。

2.4 统计学方法 应用SPSS20.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s） 表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组心肌组织超微结构变化 正常组及假手术组大鼠心肌细胞内肌丝、肌节结构清晰，排列整齐，线粒体排列整齐，肌原纤维结构正常（见图1）。CLP术后24h，模型组大鼠心肌细胞线粒体肿胀，部分空泡变性，大部分心肌细胞出现自溶，偶见心肌细胞呈核固缩、胞浆崩解等坏死改变。丹红组大鼠心肌细胞损伤程度轻于模型组（见图1）。

图1 各组心肌组织超微结构图A正常组（×8200）；B假手术组（×16500）；C模型组术后24h（×16500）；D丹红组术后24h（×16500）

3.2 各组心肌组织MDA及SOD含量变化 CLP术后24h，与正常组、假手术组比较，模型组和丹红组大鼠心肌组织MDA含量明显升高（P＜0.05），SOD活力显著降低（P＜0.05）；丹红组大鼠心肌组织MDA含量较模型组降低（P＜0.05），SOD活力较模型组升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心肌组织MDA和SOD含量比较（±s）

表1 各组大鼠心肌组织MDA和SOD含量比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

正常组假手术组模型组丹红组6666 1.0889±0.0195 1.1506±0.1771 5.5706±1.3251*△3.9900±1.0559*△▲21.1895±4.1127 20.5604±3.1312 10.5276±3.0568*△15.5129±3.4425*△▲

3.3 各组心肌组织HMGB1变化 CLP术后24h，与正常组、假手术组比较，模型组、丹红组大鼠心肌组织HMGB1蛋白表达量明显增加（P＜0.05）；丹红组大鼠心肌组织HMGB1蛋白表达量较模型组降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织HMGB1表达量比较（±s）

表2 各组大鼠心肌组织HMGB1表达量比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05；HMGB1：高迁移率族蛋白1

正常组假手术组模型组丹红组6666 0.1364±0.0377 0.1427±0.0345 0.6074±0.0504*△0.5010±0.1049*△▲

4 讨 论

脓毒症是临床常见危急重症，中医无“脓毒症”的病名，但从临床表现来看，现多将其归于“外感热病”或“温热病”范畴，对其病机认识虽未统一，但绝大多数医家对其病机认识为“正气亏虚、温毒内侵、瘀血内结”[2-3]，其中正气亏虚是基础病机，温毒内蕴是主要病因，而瘀血内结在脓毒症的发展过程中起重要作用。瘀血最常阻塞脉络，而心主血脉，因此，脓毒症心肌损伤是脓毒症发展中重要的一环。我们的前期研究表明，活血化瘀法可降低脓毒症大鼠的心肌损伤[4]。本研究以电镜观察脓毒症大鼠心肌细胞超微结构，发现脓毒症大鼠心肌线粒体肿胀，部分肌纤维稀疏；部分心肌细胞空泡变性，部分心肌细胞出现自溶，偶见心肌细胞呈核固缩、胞浆崩解等坏死改变。丹红组心肌病变较模型组心肌损伤轻微，表明丹红注射液具有减轻脓毒症大鼠心肌损伤的作用。

脓毒症心肌损伤的具体机制目前尚未完全明确，但大多认为与氧自由基损伤、炎症失控等有关。氧自由基是心肌抑制的主要始动因子之一，可引起脂质过氧化蛋白氧化水解ATP耗竭DNA破坏催化花生四烯酸代谢，从而使心肌细胞功能受到抑制，降低心肌收缩力，减少心排血量，引起脓毒血症时的心肌冬眠[5-6]。同时，氧自由基作为机体内一种活跃的小分子，参与了炎性介质的级联放大细胞凋亡Ca2+通道及自身氧化平衡的调节，造成细胞膜流动性与Ca2+通透性增加，破坏了细胞膜结构完整性，导致钙跨膜内流与钙超载，最终导致心肌细胞损伤[7]。MDA是氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的稳定代谢产物，可使DNA、RNA发生交联，继而出现断裂和失活，其含量变化间接反映了氧自由基含量的变化。SOD是生物体内专一清除超氧阴离子的特异性抗氧化酶，能清除氧自由基，保护细胞免受损伤，SOD活力的高低能间接反映机体清除氧自由基的能力。本研究结果显示，CLP术后24h，MDA含量显著升高，而SOD活力则降低，表明脓毒症时，机体产生大量氧自由基，体内清除氧自由基的能力降低，脂质氧化和抗氧化失平衡，与某些细胞因子的生成相互促进，形成恶性循环，促成脓毒症及脓毒症心肌损伤的发生发展。丹红组MAD含量及SOD活性均较模型组有所改善，表明丹红注射液可改善自由基代谢，清除氧自由基，保持脂质氧化和抗氧化处于平衡状态，保护生物体免受自由基攻击的作用，进而保护脓毒症心肌损伤。

炎症介质在脓毒症的发生发展中起着决定性的作用，高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种高度保守的DNA结合蛋白，与核小体结构的修复及基因转录调控密切相关。HMGB1由坏死细胞或活化的单核/巨噬细胞被动或主动释放至细胞外，并发挥促炎和修复作用。HMGB1在脓毒症发生过程中扮演晚期促炎细胞因子的角色，参与脓毒症的病理生理过程，介导内毒素的致死效应[8]，它可通过多条途径促使炎症反应增强，最终使炎症失控迁延[9]。研究表明，严重烫伤和腹腔感染后6～24h大鼠肝、肺及小肠组织HMGB1基因表达显著增多，且一直持续至伤后72h[10]。Luan等[11]研究表明，HMGB1在重症急症胰腺炎大鼠肠黏膜的表达上调从6h开始，持续上升超过了48h。

临床观察研究也证实，HMGB1加剧炎症反应，造成急性组织损伤，且脓毒症患者的血清/血浆HMGB1水平上升与生存组相比，脓毒症患者死亡组血清HMGB1水平更高，而感染性休克患者血浆HMGB1浓度与器官损伤程度相关，病情重的患者HMGB1水平增长持续时间更长[12]。本实验结果显示，CLP术后24h，模型组HMGB1蛋白合成明显升高，与假手术比较差异显著，与文献报道相符。丹红注射液干预后，其HMGB1含量较模型组降低，表明丹红注射液可降低HMGB1含量。[本文受到浙江中医药大学一般项目（No.2010LX22）；浙江中医药大学附属第三医院一般项目（No.ZS10CA15）资助]

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（收稿：2015-05-27 修回：2015-07-13）

Effect of Danhong Injection on the Expression of Oxygen-free Radicals and HMGB1 in Heart Tissue in Rats with Sepsis

HU Dandan1,YANG Guoliang2,LOU Liming1. 1Department of Respiratory Diseases,Third Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China;2Department of Oncology,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003),China

Objective To investigate the protective effect of danhong Injection on myocardial injury in rats with sepsis and the underlying mechanism.Methods Twenty-four male Wistar rats were used to establish sepsis induced by cecal ligation and puncture（CLP）and randomly divided into 4 groups:control group,sham group,model group,and danhong injection group,with 6 rats in each group.The ultrastructure of myocardium cells was observed.The contents of malondialdehyde（MDA）and superoxidedismutase（SOD）,and the protein synthesis of high mobility group box-1 protein（HMGB1）in heart tissue were determined.Results At 24h after CLP,the MDA contents and the protein synthesis of HMGB1 in model group and danhong injection group were increased compared with sham group（MDA：5.5706±1.3251μ/mg prot and 3.9900±1.0559μ/mg prot vs 1.1506±0.1771μ/mg prot;HMGB1: 0.6074±0.0504 and 0.5010±0.1049 vs 0.1427±0.0345;all P＜0.05）,while the SOD contents decreased（10.5276± 3.0568nmol/mg prot and 15.5129±3.4425nmol/mg prot vs 20.5604±3.1312nmol/mg prot,P＜0.05）.Compared with model group,danhong injection group had lower MDA content（3.9900±1.0599μ/mg prot vs 5.5706±1.3251μ/mg prot）and HMGB1 content（0.5010±0.1049 vs 0.6074±0.0504）,and higher SOD content（15.5129±3.4425nmol/mg prot vs 10.5276±3.0568nmol/mg prot;all P＜0.05）.The mitochondrion of heart cells in model group got swelling, and most of heart cells had autopepsia.The injury of heart cells in danhong injection groups was milder than thatin model group at the same time point.Conclusion Danhong injection can protect against myocardial injury in rats with sepsis,which may be related to scavenging oxygen-free radicals and reducing the protein synthesis of HMGB1.

rats;sepsis;myocardial injury;oxygen-free radicals;HMGB1;danhong injection

浙江省自然科学基金项目（No.LY12H15004）

1浙江中医药大学附属第三医院呼吸科（杭州 310005）；2杭州市红十字会医院肿瘤科（杭州 310003）

胡丹丹，Tel：0571-88393530；E-mail：xyz3128@sina.com