核因子-κB在慢性移植肾失功中作用机制的研究

杨 俊李淦洪刘璐璐姜 华晏 强李乾伟

核因子-κB在慢性移植肾失功中作用机制的研究

杨 俊1李淦洪1刘璐璐1姜 华1晏 强2李乾伟1

目的 探讨核因子-κB（NF-κB）及其下游信号分子调节激活正常T细胞表达和分泌的细胞因子（RANTES）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）在慢性移植肾失功（CRAD）患者移植肾组织的表达及与肾间质纤维化/小管萎缩（IF/TA）和尿蛋白的关系。方法 采用免疫组化技术及计算机真彩色图像分析软件系统半定量检测103例病理诊断符合CRAD的移植肾组织NF-κB p65、RANTES及MCP-1表达量，并分析其表达与CRAD移植肾组织IF/TA、血肌酐及24h尿蛋白的关系。10例移植前零点穿刺正常肾组织作为对照组，入院行血清肌酐及24h尿蛋白定量检测。结果移植肾组织NF-κB p65表达较正常肾组织明显升高［（22.63±6.37）%、（38.59±5.36）%、（53.36± 8.77）%比（7.83±0.57）%，P＜0.01］；其表达水平同炎症细胞趋化因子RANTES、MCP-1及IF/TA病理分级呈正相关（r分别为0.736、0.857和0.904，P均＜0.01）；NF-κB p65的表达与炎症细胞浸润亦具有正相关性（r=0.851，P＜0.01）；血肌酐及24h尿蛋白定量的变化随IF/TA病理分级增加而升高（r=0.902和0.870，P均＜0.01）。结论 在CRAD患者移植肾组织中，NF-κB p65表达明显增强，NF-κB p65及炎症趋化因子的高表达与移植肾间质炎症细胞浸润、肾间质纤维化及慢性移植肾失功等表现密切相关，提示它们可能参与了慢性移植肾功能不全的发生和发展。

慢性移植肾失功；间质纤维化/肾小管萎缩；肾移植；核因子-κB

目前研究已知，核因子-κB（NF-κB）是一种与炎症性细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8）、炎症趋化因子（RANTES、MCP-1）产生及细胞外基质（ECM）沉积有关的重要的核转录因子，NF-κB在各种因子相互影响的复杂网络中起着中心调控的作用[1]。在各种不同的肾脏疾病中，包括慢性移植肾失功（chronic renal allograft dys-function，CRAD），慢性炎症反应的发生是导致肾单位进行性丢失的共同的病理过程[2]。影响移植肾长期存活的主要因素为：心血管方面疾病和慢性移植肾失功（chronic renal allograft dysfunction，CRAD）[3]。目前尚无NF-κB在CRAD患者移植肾组织中的表达及其同肾间质纤维化/小管萎缩（IF/ TA）关系的相关研究，本研究采用免疫组化方法对CRAD患者移植肾组织NF-κB p65及相关趋化因子进行检测，同时检验患者24h尿蛋白及血肌酐，分析NF-κB p65同24h尿蛋白、血清肌酐及IF/TA的关系，探讨NF-κB p65在CRAD发病机制中的作用，为移植肾慢性纤维化的发生、发展及治疗提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集从2008年6月—2014年2月在我院住院的肾移植患者103例，其中尸体供肾95例，活体供肾8例。术后出现肌酐升高、蛋白尿，行移植肾穿刺病理活检术，按照Banff 2013移植肾病理分级诊断标准[4]，诊断为慢性移植肾失功，男53例，平均年龄（46.8±9.3）岁；女50例，（43.1±9.7）岁。肾穿时间为肾移植术后0.5～14.5年，血肌酐（630.8±97.1）μmol/L。其中，52例接受环孢素+吗替麦考酚酯+泼尼松三联免疫抑制治疗方案，51例接受他克莫司+吗替麦考酚酯+泼尼松三联方案治疗。术前所有供、受者的血型相同，淋巴细胞毒交叉配型试验（CDC）＜10%，HLA-A、HLA-B、HLA-Dr位点至少有二个位点相配。以10例正常肾组织零点穿刺标本作为对照组，病理检查无异常，年龄19～54岁。

1.2 病理分级诊断标准 依据Banff 2013移植肾病理分级诊断标准[4]，按照IF/TA严重程度分为：Ⅰ级：轻度间质纤维化和肾小管萎缩（＜25%的皮质受累）；Ⅱ级：中度间质纤维化和肾小管萎缩（26%～50%的皮质受累）；Ⅲ级：重度间质纤维化和肾小管萎缩（＞50%的皮质受累）。肾管间质炎症细胞浸润分度：轻度 散在炎症细胞浸润；中度：局灶性浸润；重度：大片、弥漫性浸润。

1.3 移植肾组织NF-κB p65、RANTES和MCP-1检测 均应用免疫组化EnVision法，石蜡切片3μm，常规烤片，脱蜡至水，3%过氧化氢清除内源性过氧化氢酶，10mM柠檬酸钠（pH6.0）缓冲液修复抗原，煮沸20min。分别滴加一抗鼠抗人NF-κB p65单克隆抗体（1:100稀释，Santa Cruz公司产品，编号ZS-8008）、RANTES兔抗人单克隆抗体（1:200稀释，武汉博士德公司产品，编号BA-1383）和兔抗人MCP-1单克隆抗体（1:100稀释，武汉博士德公司产品，编号BA-1254），4℃下过夜，PBS液冲洗，滴加二抗（福州迈新公司提供），37℃温箱孵育30min，PBS液冲洗，二氨基联苯胺（DAB）显色，再经苏木素复染，脱水，封片，观察。

10例移植前零点穿刺正常肾组织用PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照。同时均行Masson，PASM等免疫组化检测。

1.4 免疫组化染色半定量分析 采用德国Leica（DMR+Q550型）真彩色病理图像分析系统对染色结果进行半定量分析，随机选取10个不连续（避开肾小球和大血管）的肾小管间质视野（×400，HPF），每例肾小管总数大于60个。使用ImagePro-Plus6.0软件计算平均光密度，取其均值表示该种成分在肾小管和间质的相对含量。

2 结果

2.1 组织学改变 移植肾慢性排斥反应发生时，组织学改变主要表现为：小球系膜基质增宽，间质有灶性单核细胞浸润（见插页图1）；PASM染色可见：系膜细胞及基质中-重度增生，局部包曼氏囊壁增厚、分层，基底膜增厚，基底膜呈连环样改变和假双轨征；Masson染色组织学表现为：小球呈节段硬化，包蔓氏囊增厚、分层，间质中度纤维化伴有炎症细胞浸润，小管上皮萎缩，病变如图中箭头所示。不符合急性排斥反应、免疫抑制剂慢性肾毒性损伤等其他肾病病理改变。

2.2 肾组织NF-κB p65表达 NF-κB p65在正常肾组织表达甚少。在CRAD患者移植肾组织中，NF-κB p65主要表达于肾小管上皮细胞及肾间质，较对照组显著增加（P＜0.01），其表达水平同RANTES、MCP-1及IF/TA病理分级呈正相关（r分别为0.736、0.857和0.904，P均＜0.01）；同时，移植肾组织中NF-κB p65的含量同炎症细胞浸润程度、血肌酐水平及24h尿蛋白量亦具有正相关性（r分别为0.851、0.887和0.926，P＜0.01）。见表1～2，插页图2。

表1 正常肾组织及移植肾间质NF-κB p65、RANTES和MCP-1阳性面积百分比及相应肌酐水平同IF/TA分级的关系（±s）

表1 正常肾组织及移植肾间质NF-κB p65、RANTES和MCP-1阳性面积百分比及相应肌酐水平同IF/TA分级的关系（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与IF/TA-Ⅰ级组比较，△P＜0.01；与IF/TA-Ⅱ级组比较，▲P＜0.01

组别对照组IF/TA-Ⅰ级组IF/TA-Ⅱ级组IF/TA-Ⅲ级组例数10 51 40 12 NF-κB p65（%）7.83±0.57 22.63±6.37* 38.59±5.36*△53.36±8.77*△▲RANTES（%）0.95±2.67 25.31±4.89* 46.73±8.24*△59.87±5.43*△▲MCP-1（%）2.78±1.56 33.65±4.73* 53.91±6.75*△64.93±5.62*△▲Scr（μmol/L）78.45±6.47 215.89±22.60* 437.05±56.69*△943.73±65.25*▲尿蛋白定量（g/24h）0.06±0.32 0.64±0.47* 1.86±1.28*△2.65±1.87△▲

表2 CRAD患者肾组织NF-κB p65、RANTES和MCP-1表达面积百分比和炎症细胞浸润程度关系（±s）

表2 CRAD患者肾组织NF-κB p65、RANTES和MCP-1表达面积百分比和炎症细胞浸润程度关系（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与轻度浸润组比较，△P＜0.01；与重度浸润组比较，▲P＜0.01

组别 例数NF-κB p65（%）RANTES（%）MCP-1（%）

2.3 RANTES表达 RANTES在正常肾组织中的表达量非常少。CRAD患者移植肾组织中RANTES大量表达于肾小管上皮细胞、肾小球系膜区及间质内浸润的单核巨噬细胞；并且RANTES的表达随着间质纤维化/小管萎缩的程度加重而增多，具有正相关性（r=0.916，P＜0.01）；RANTES的表达同炎症细胞浸润程度、血肌酐水平及24h尿蛋白量亦具有正相关性（r分别为0.894、0.875和0.936，P＜0.01）。见表1～2，插页图3。

2.4 MCP-1表达 正常对照组肾组织中MCP-1在表达很低。发生慢性排斥反应时，移植肾组织中MCP-1表达显著增加，主要表达在肾小管上皮细胞胞浆、肾小球系膜区，MCP-1的表达水平随着IF/TA病理分级及炎症细胞浸润程度的增加而增加，具有正相关性（r=0.917和0.865，P＜0.01）；MCP-1表达同血肌酐水平及24h尿蛋白量亦具有正相关性（r= 0.827和0.856，P＜0.01）。见表1～2，插页图4。

2.5 血肌酐水平及24h尿蛋白量 在正常肾组织中，血肌酐水平及24h尿蛋白量同NF-κB p65的表达无关联（r=0.138和0.269，P分别为0.316和0.254）；而在CRAD患者移植肾组织中，血肌酐水平及24h尿蛋白量随着IF/TA病理分级的增加而升高，具有正相关性（r=0.902和0.870，P均＜0.01），移植肾组织损伤越严重，血肌酐水平及24h尿蛋白量越高。见表1～2。

3 讨 论

NF-κB是普遍存在于细胞浆中的一种的核转录因子，包括5种亚基：P65（RelA）、P50、cRel、RelB及p52，最常见的结合形式是p50/p65异源二聚体，p65是其主要的功能单位。在正常情况下，NF-κB二聚体与其抑制蛋白IκB构成复合物，以失活的状态存在于细胞浆中。NF-κB可被许多刺激原激活，如尿蛋白、有丝分裂原、氧化应激和血管紧张素Ⅱ等，这些因素可使IκB磷酸化而被降解，促使NF-κB释放，从胞浆中转移至细胞核内，调节下游多种细胞因子的转录和合成，其激活的靶基因包括趋化因子（RANTES、MCP-1）、细胞黏附分子和炎症细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF）等基因[5]；这些炎症因子同时又可以作为NF-κB的激活剂，反过来激活NF-κB，如：IL-1和TNF[6]，而形成瀑布式级联放大反应加重肾脏炎症反应，促进肾间质纤维化的发生。

本研究结果显示，NF-κB p65在CRAD患者移植肾组织中表达较正常组明显升高，其表达水平随着IF/TA病理分级及炎症细胞浸润程度的增加而增多，具有正相关性；另外，NF-κB p65的表达同移植肾间质RANTES和MCP-1的水平呈正相关，同文献报道一致[7]；同时，RANTES和MCP-1在CRAD患者移植肾组织中的表达强度与IF/TA的病理分级与炎症细胞浸润的程度亦呈正相关，与我们过去在CRAD研究中的发现有一致性[8]；还有，反映肾功能的指标血肌酐水平和24h尿蛋白定量均随着NF-κB p65表达量的增加而升高，我们推测，CRAD患者移植肾间质IF/TA病理分级和肾功能下降的程度可能与移植肾间质炎性介质的表达以及炎症细胞的浸润有着密切的关系，作为肾间质炎症反应的中心环节[9]，炎性介质NF-κB介导的炎症级联放大反应可能参与了CRAD患者移植肾IF/TA及慢性移植肾失功的发生与发展。

在炎症性肾脏疾病中，包括CRAD，由于肾移植术后患者长期服用免疫抑制剂及激素，导致血脂代谢紊乱、高血糖及蛋白尿等并发症，这些因素均可激活NF-κB。NF-κB的活化是一个重要的细胞信号事件，它控制着一系列炎症介质的转录，由于NF-κB处于介导炎症反应发生的关键环节，故有必要进一步讨论NF-κB介导的炎症反应在慢性移植肾失功中的作用机制，为尽早阻断这种级联放大效应，预防和控制慢性移植肾失功的进展提供一条可能的途径。

已知，炎症细胞的浸润与活化是肾间质纤维化发生、发展过程中的重要始动环节之一[10]。研究[11]表明，肾间质中巨噬细胞浸润的数量与肾脏纤维化程度成正比，当抑制编码巨噬细胞生成的基因表达或敲除巨噬细胞基因时，肾间质纤维化程度得以减轻。RANTES和MCP-1属于CC类趋化因子，具有强大的促炎作用，它们在炎症细胞的浸润、活化及移植肾纤维化发生、发展中起着重要的作用。RANTES和MCP-1不仅能趋化和激活T淋巴细胞、单核巨噬细胞外，还能被其分泌，更加加重了炎症细胞的聚集和活化和肾间质的损伤[12-13]。同时，相关研究已经证实，NF-κB的活化对于RANTES[14]和MCP-1[1]的表达起着非常重要的作用，它能够调控RANTES和MCP-1的表达，从而影响淋巴细胞、单核/巨噬细胞等炎症细胞的浸润和活化，在细胞外基质的产生和肾纤维化的病程中起着重要的作用。

包括CRAD在内的各种不同的肾脏疾病中，慢性炎症反应的发生可导致肾单位进行性丢失，炎症细胞在肾间质的浸润是导致肾间质纤维化的重要原因之一。Zhou等[15]的研究证实，尿酸可通过活化NF-κB信号通路，诱导RANTES和MCP-1的表达，促进肾脏炎症的发生，同时，RANTES的高表达可被NF-κB特异性的抑制剂所阻断。炎症细胞表面的RANTES受体能够被趋化因子受体拮抗剂Met-RANTES有效的阻断，显著的减少了移植肾间质炎症细胞的浸润和活化，抑制IF/TA的发生。Wu等[16]研究表明，肝细胞生长因子（HGF）能够通过阻断NF-κB信号通路，抑制RANTES和MCP-1的表达，减少肾间质T淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，同时肾间质纤维化的程度明显减轻。说明炎症细胞在肾间质中的浸润和活化在肾间质纤维化的发生、发展和肾功能减退的进程中均起着重要的作用；同时，NF-κB p65的激活对于炎症细胞的浸润起着关键的调节作用。

结合本实验，在CRAD患者移植肾组织中，NF-κB的异常高表达，通过诱导其下游信号分子RANTES和MCP-1表达量的增加，从而导致大量淋巴细胞、单核/巨噬细胞等炎症细胞浸润和活化，这些炎症细胞除了能分泌炎症因子介导持续性的肾间质损伤外，还能产生大量的致纤维化因子，如TGF-β、PDGF等，促进细胞外基质（ECM）、Ⅳ型胶原的产生，导致移植肾纤维化；同时，它们还能产生抑制ECM的降解的物质如纤维酶原激活物抑制剂（PAI-1）和金属蛋白酶抑制物（TIMP-1）等，参与了肾纤维化的发生[17]；另外，NF-κB还能促进α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达，导致肌成纤维细胞的成熟[18]，在移植肾间质中产生大量ECM。可见，NF-κB能通过诱导炎症细胞的浸润和促进肌成纤维细胞的生成，生成大量的ECM，使ECM的产生和降解失衡，导致移植肾间质纤维化的发生。

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（收稿：2015-05-25 修回：2015-07-01）

Expression of NF-κB p65 in Renal Tissue from Patients with Chronic Renal Allograft Dysfunction

YANG Jun1,Li Gan Hong1,LIU Lulu1,JIANG Hua1,YAN Qiang2,Li Qian Wei1. 1Department of Urology,Fifth Affiliated Hospital(Zhuhai Hospital),Zunyi Medical University,Zhuhai(519100),China;2Military Center for Renal Transplantation&Dialysis,No.181 Hospital,Nanfang Medical University,Guilin(541002),China.

Objective To investigate the expression of NF-κB p65 and its downstream signal molecules in renal tissue with chronic renal allograft dysfunction（CRAD）,and explore their relationship with interstitial fibrosis and tubular atrophy（IF/TA）and urine protein.Methods Immunohistochemical assay and computer-assisted genuine colored image analysis system were used to detect the expression of NF-κB p65,regulated on activation normal T cells expressed and secreted（RANTES）and monocyte chemoattractant protein 1（MCP-1）in 103 renal allografts with CRAD.The relationship of NF-κB p65,RANTES,MCP-1 in renal allografts with IF/TA,serum creatinine and 24h urine protein were analyzed.Ten specimens from healthy renal tissue were used as controls.Results Compared to normal tissue,the expressions of NF-κB p65 were significantly higher in renal tissue with CRAD（IF/TAI:22.63%±6.37%,IF/TA-II:38.59%±5.36%,IF/TA-III:53.36%±8.77%vs control:7.83%±0.57%,P＜0.001）,and the expressions were positively related to the pathological grade of IF/TA and RANTES and MCP-1（r=0.904, 0.736,and 0.857,respectively,all P＜0.001）.The expression of NF-κB p65 was positively related with inflammatory cellular infiltration（r=0.851,P＜0.001）;serum creatinine level and 24h urine protein were increased with IF/TA grades（r=0.902 and 0.870,all P＜0.001）.Conclusion The expression of NF-κB p65 in renal allografts is increased and is closely related to up-regulated RANTES and MCP-1,inflammatory cellular infiltration,IF/TA,and chronic allograft dysfunction.This may indicate the involvement of NF-κB p65 and its downstream signal molecules in progression of chronic renal allograft dysfunction.

chronic renal allograft dysfunction;interstitial fibrosis and tubular atrophy;renal transplantation; NF-κB

1遵义医学院第五附属（珠海）医院泌尿外科（珠海519100）；2南方医科大学附属解放军第181医院全军肾移植与透析中心（桂林541002）

姜华，yonghongjiang@163.com