S基因进化树分析证实乙型肝炎病毒存在性传播途径

李康 ，颜和芳 ，赵蔚 ，罗艺 ，徐文莉 ，廖长征 ，张洪德

(1、龙岗中心医院，深圳 龙岗518116；2、宝安区慢性病防治院，深圳 宝安518126)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种严重危害人类健康的传染病，我国是HBV高流行区，约9.7%的人为HBV携带者[1]。乙型肝炎病毒(HBV)性传播途径已研究多年并被基本证实[2，3]，但既往研究主要基于宏观流行病学研究和动物实验，尚未找到人与人之间HBV性传播的确切证据。近年来，随着分子流行病学的发展，越来越多的传染病传播途径通过分子进化分析在分子水平得到证实[4]。本研究选择疑似发生HBV性传播的夫妻，使用基因序列比对及基因进化树分析等分子流行病学方法分析其所染HBV S基因，试图从分子水平证实HBV存在性传播途径。

1 材料与方法

1.1 标本来源 从2010年来深圳市龙岗中心医院体检科做婚检的夫妻中按照乙肝表面抗原结果筛选出女方阳性而男方阴性的夫妻36对，除5对男方注射乙肝疫苗而乙肝表面抗体阳性外，其余31对夫妻中男方乙肝两对半均为全阴性。对这31名男性乙肝表面抗原每年随访检测一次，至2014年，其中10名男性乙肝表面抗原由阴性变为阳性，且期间夫妻双方均无输血史。此10对夫妻作为病例组，女方使用一次性无菌采样管采集阴道分泌物标本，每管加入无菌生理盐水1ml，震荡混匀，分别标记为W1-W10，-80℃保存；男方采集静脉血分离血清，分别标记为H1-H10，-80℃保存。另外随机选择10名来深圳市龙岗中心医院感染科就诊的血HBV-DNA阳性的男性乙型肝炎患者与上述10夫妻中女方随机配对作为对照组，采集其静脉血分离血清，分别标记为U1-10，-80℃保存。病例组与对照组年龄、体重均无显著性差异。

1.2 DNA提取 解冻阴道分泌物和血清标本。阴道分泌物充分震荡混匀后，吸取1ml至1.5ml离心管中，12000r/min离心5min，吸弃上清液，每管保留50μl上清液，勿触及底部细胞团，重新漩涡震荡后备用。向50μl阴道分泌物、血清标本中分别加入150μl含0.5%十二烷基磺酸钠 (SDS)，1mg/ml蛋白酶 K，2.5mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)，25mmol/l醋酸钠的裂解液，68℃裂解2h后，用苯酚、氯仿、异戊醇法提取HBV-DNA[5]。

1.3 基因测序及序列比对 针对乙肝病毒S基因设计巢式PCR引物。外引物1位于HBV基因序列的nt842-822(5’TTAGGGTTTAAATGTATACCC3’)，外引物 2 位于 nt56-76(5’CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC3’)，扩增片 段 为 787bp。 内 引 物 1位 于 nt427-448(5’CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG3’)， 内 引 物 2 位 于nt687-668(5’GGCACTAGTAAACTGAGCC3’)。 使用ABI7500 PCR仪进行巢式PCR反应，扩增片段为261bp。第一轮PCR产物1:50稀释后作为第二轮PCR的模板，每轮PCR均设置阳性、阴性对照，PCR方法参考王珊珊等报道[6]。PCR扩增产物送至北京六合华大基因科技有限公司广州分公司进行高通量测序。使用DNAstar软件包中的MegAlign软件进行多序列比对及基因进化树绘制[7]。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计学处理。计量资料符合正态分布的采用均值±标准差(x±s)表示，使用独立样本t检验对病例组和对照组的基因序列相似性进行比较。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV S基因序列比对结果显示病例组S基因序列相似性高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表 1。

表1 病例组与对照组HBV S基因序列相似性比较(s)

表1 病例组与对照组HBV S基因序列相似性比较(s)

组别 数量 序列相似性病例组对照组t值P值10 10 0.9961±0.0019 0.9774±0.0051 10.89<0.05

2.2 基因进化树分析 基因进化树显示H3-W3，H5-W5，H6-W6，H7-W7，H9-W9 分别处于同一独立遗传分支，存在非常密切的同源进化关系。H8-W8-U3，H10-W10-U5分别处于同一独立遗传分支，说明H8-W8，H10-W10存在较密切同源进化关系，但其相互间序列相似性并不比无关感染者U3，U5 高。H1-W1，H2-W2，H4-W4 均不在同一独立遗传分支，同源进化关系较远。见图1。

图1 30例患者HBV S基因进化树分析

3 讨论

近年来，随着分子生物学和现代流行病学的飞速发展，乙型肝炎的流行病学研究已经进入了分子流行病学时代。使用基因序列差异评估，种系发育分析等分子流行病学手段，可在分子水平对乙型肝炎病毒的不同传播途径予以证实。

本研究中病例组女性选择阴道分泌物标本，巢式PCR扩增结果显示10名女性HBV-DNA均呈阳性，说明病例组女性患者阴道分泌物具有传染性，具备通过性途径传播HBV的潜在可能。由于HBV的DNA聚合酶是一种反转录酶，缺少3′→5′核酸外切酶活性(此酶可切除不合理插入的核苷酸)，因而缺乏校正的功能，且HBV复制产量高，可达1012-1013病毒颗粒/天，因而导致HBV DNA复制中错误发生率远高于其他DNA病毒，约为每个位点每年核

苷酸替代率1.4~3.2×10-5[8-10]。如此高的错误发生率造成HBV的高变异率，也导致不同感染者体内HBV-DNA序列存在一定差异，且序列差异随着传染距离的增长而增大。鉴于本研究病例组选择为疑似性传播病例，已基本排除男方由其他途径感染HBV的可能，因此病例组中女方与其丈夫所感染HBV S基因序列相似性显著高于病例组中女方与随机选择的无关男性乙肝患者HBV S基因序列相似性，可在分子水平证实病例组中男方所感染HBV由其配偶传染而来。

对参与研究的30名患者HBV S基因序列做基因进化树分析进一步揭示了病例组、对照组间HBV更为详细的同源进化关系。10对病例组中，有 5 对(H3-W3，H5-W5，H6-W6，H7-W7，H9-W9)处于同一个单独的遗传分支中，特别是H6-W6两人HBV S基因序列完全相同，显示出非常密切的同源进化关系，证实这5对患者中，男方所染HBV由女方即其妻子传播而来。H8-W8-U3，H10-W10-U5分别处于同一独立遗传分支，显示出H8-W8，H10-W10间HBV较密切的同源进化关系，但其相互间序列相似性并不比H8-U3，H10-U5高，说明 H8，H10所染 HBV可能由 W8，W10传播而来，但几率与从其他无关传染源传播而来无显著差异。H1-W1，H2-W2，H4-W4虽然进化距离较近但均不在同一独立遗传分支，其中H1与W7，H7在同一个独立遗传分支，W2与U7在同一个独立遗传分支，W4与U8，U9在一个独立遗传分支，说明H1-W1，H2-W2，H4-W4间HBV存在一定的同源进化关系，但相互间同源进化关系较H1-W7，W2-U7，W4-U8间同源进化关系更远，故认为H1，H2，H4 所染 HBV 可能不是从 W1，W2，W4 传播而来。HBV S基因进化树分析进一步从分子水平证实10对疑似性传播HBV夫妻中5对存在夫妻间HBV传播。

综合序列比对和基因进化树分析结果，可以证实HBV存在夫妻间传播，10对夫妻中，5对夫妻中男方所染HBV由女方传播而来。鉴于本研究中女方选择的标本为阴道分泌物标本，且既往研究也证实虽然HBV携带者唾液中可检出HBVDNA[11-13]，但HBV并不通过共用餐具，拥抱，接吻，握手，咳嗽，喷嚏等途径传播[14，15]，因而排除了夫妻间通过其他非性途径传播的可能性，进一步证实5对发生HBV夫妻间传播的病例中男方所染HBV由女方通过性途径传播而来。从而最终从分子水平证实HBV可经性途径传播。当然本研究仅证实HBV感染女性可通过性途径将HBV传染给健康男性，男性HBV携带者是否也可将HBV通过性途径传染给女性或者男性性伴侣尚需要进一步的深入研究来证实。

HBV的性传播途径虽早已通过大量流行病学研究及少量动物实验获得证实，但人与人之间HBV性传播的直接证据却一直难以获得。本文使用分子流行病学方法首次在分子水平证实了人与人之间性传播途径的存在，显示出基因序列比对，基因进化树分析等分子流行病学手段在研究传染性疾病传染源和传播途径方面的巨大价值，为大量已知传染病传染源和传播途径的精确分析和分子水平证实以及新发现传染病传染源与传播途径的快速确定提供了强大的研究工具。当然此方法也存在一定的局限性。其主要局限性在于研究的病原体应属于变异率较高的高变异病原体，对于变异率较低的病原体，由于其不同感染者所带病原体基因序列差异较小，是否能通过序列比对和基因进化树分析确定其传染源和传播途径仍有待进一步深入研究。

本研究从分子水平证实HBV存在性传播途径，可经性途径由女性传染给男性。女性HBV感染者的健康性伴侣是HBV感染的高危人群，对此类高危人群的HBV预防不仅要及时接种乙肝疫苗并定期监测乙肝表面抗体，还要加强安全性行为的教育，倡导使用避孕套，以阻断HBV的性传播途径。

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