滤纸片低温冷冻法保存微生物菌株的临床应用

2015-06-14曹美林李佳邓慧殷网虎

实验与检验医学 2015年3期

关键词：离心管滤纸铜绿

曹美林，李佳，邓慧，殷网虎

(镇江市中医院检验科，江苏镇江212003)

菌种保存方法众多，选取建立一种保存期长、占用空间小，简便易行的保存方法，使菌种的生命以及生物学特征得到有效延续是广大医学工作者探讨的重要课题[1，2]。我院微生物实验室采用滤纸低温冷冻法保存临床菌株，取得了较好的效果，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌种金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853，菌株均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.2 临床菌株观察对象为本室临床分离菌株，包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、白念珠菌等。

1.1.3 菌株保存管取新华定性滤纸，剪成大小约15mm×3.5mm，放入1.5ml带盖塑料离心管内，每管1~2片，将离心管编号，用离心管盒装载，121℃灭菌30min后备用[3]。

1.1.4 培养基和仪器营养琼脂、SS培养基、哥伦比亚血平板、麦康凯培养基等培养基由上海科玛嘉微生物技术有限公司生产；珠海迪尔细菌鉴定系统及配套的细菌鉴定条；三洋Biomedical Freezer低温冰箱。

1.2 方法

1.2.1 保存方法将室内质控菌种在血琼脂培养基上分离纯化，用消毒钳子钳上滤纸片于平板上刮取，每片尽可能刮取较多的菌苔。放于带盖塑料离心管内，盖上盖子，每菌36管，写上菌名，置于低温冰箱的-20℃冷冻保存。对于临床日常分离出的阳性菌株，先分纯目的菌，完成鉴定药敏操作，然后用消毒小钳子钳上滤纸片留取部分剩余菌种，于-20℃冷冻保存，并详细填写保存登记本。

1.2.2 检测方法质控菌株：每月取出一支保存管，每周一用无菌镊子夹出菌种纸片，在哥伦比亚血平板上轻轻涂抹，37℃培养复苏。剩余纸片仍放回离心管内，迅速放冰箱冷藏保存。按照室内质控要求，每周用复苏菌种做药敏质控，同时做生化鉴定，观察菌株生化特性。临床菌株：根据保存时间的长短，按照保存期 6、12、18、24 个月，每个时间段分别随机从本室保存菌库内抽取目标菌株复苏，检测细菌的存活情况，并观察菌落性状、菌体形态，检测有关生化指标，比较各菌株的生物学特性是否发生变化。包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、白念珠菌，数量均为3株。

2 结果

2.1 保存期内3株标准菌株变异情况 2011年11月起本室采用滤纸法保存的铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠埃希菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球(ATCC29213)3株标准菌株，定期按照本室的方法进行复苏使用，至2013年12月底，菌种存活率均为100%。铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠埃希菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球(ATCC29213)在存活期内，细菌形态、染色特性、生化反应等均无明显变化，药敏质控结果非常稳定，说明菌株未发生变异。详细药敏质控结果见表1。

表1 3株标准菌株保存2年期间药敏MIC试验结果与参照结果对比(μg/ml)

2.2 7种常见菌株的存活情况在采用滤纸法保存的临床菌株库中，从保存期分别为6、12、18、24个月的菌株中，随机抽取铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、白念珠菌各3株。接种哥伦比亚血平皿和沙保罗琼脂斜面培养基，经35℃培养18~24h，每个保存期抽取的21株菌存活率均为100%，菌落形态特征无明显改变且生长良好。详细结果见表2。

表2 不同保存期7种临床常见菌的存活情况

2.3 本室临床菌株保存情况自2011年11月份本室采用滤纸法保存菌种以来，至2013年12月31日已保存菌株1300株。临床分离菌株主要以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌等为主。详细保存情况见表3。

表3 本室细菌库中分离占前10位的菌种情况

3 讨论

为了微生物检验的质控工作[4]，进行菌株的分子生物学特征和耐药性变迁进行监测，以及科研教学[5]等方面的需要，长期保存菌株已成为临床微生物实验室的重要工作。菌株的保存方法较多，有明胶片法[5]、磁珠保存法[6]、半固体法[7]、滤纸石蜡法[8]、滤纸法[9]、甘油-生理盐水法[10]等等，在诸多菌种保存方法中，真空冷冻干燥法效果最佳，但由于设备要求高，制备程序繁杂、占用空间大等缺点，只适用于保存小批量菌种，如乳酸菌的保存等[11]，并不适合临床大批量的菌种保存[12]。

我们采用滤纸法保存的菌种，通过2年对非苛养菌的观察，保存的菌株性状稳定，未发现菌种变异、死亡现象。由于我院检出的苛养菌数量较少，未进行保存性能观察。但相关文献多提示[9]，用滤纸法保存的苛养菌时间较短，效果不是十分理想。杨旭等用滤纸法将流感嗜血杆菌、肺炎链球菌保存一年后，存活率分别是6/10、7/10，存在一定数量的菌种死亡现象[13]。而庞璐等以中药茨实、山药作为保养液，用滤纸法保存甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌2年，菌种未发生死亡，提示滤纸法配合中药可以提高苛养菌保存周期[14]。

有作者[14]将滤纸条单独包装消毒，保存时临时从包装内取出，这样做的缺点是多了一道环节，增加了污染的可能性，所以我们根据文献[15]对方法进行了改良，省去这一环节，直接将滤纸条放入离心管内，然后进行消毒灭菌，应用几年来未发现菌株污染的情况。

我们的应用体会是，纯化菌株做完鉴定和药敏，一定要在当日保存菌种，如果保存不及时，细菌老龄化，一方面容易发生变异，另一方面菌株容易死亡。至于质控菌株，根据经验，可以在购进时，将菌种分离培养，用滤纸法分装3~5年的用量，这样可以保证实验室每次使用的都是一代菌，从我们的使用情况来看，效果非常满意。

综上所述，滤纸片低温冷冻法保存菌种材料简单、经济，操作方便、占用空间小，能避免因反复传代而引起的菌种变异，是适合临床实验室大批量保存非苛养菌的一个好方法。

[1]杨应虹,罗有福,李子成.抗耐药金黄色葡萄球菌新药的研究进展[J].华西药学杂志,2010,25(4):494-496.

[2]陆贞玉.食品中金黄色葡萄球菌及其检测方法现况[J].预防医学情报杂志,2010,26(11):892-894.

[3]干迪郁,任利珍,朱立军.两种不同的细菌菌种保存方法比较[J].中国乡村医药杂志,2010,17(1O):49-50.

[4]帅丽华,胡志坚,孙晓红,等.临床微生物检验质量保证和持续改进[J].实验与检验医学,2012,30(5):456-458.

[5]王红,何晓冬,王典高.明胶片菌种保藏法的应用[J].现代预防医学,2010,37(16):3138-3139.

[6]陈晓燕,林光.微生物实验菌种保存方式探讨[J].临床合理用药,2014,7(10):129-130.

[7]彭俊华,薛荣利,张媛媛,等.三种常用方法保存临床常见菌种的比较[J].甘肃科学学报,2012,24(3):88-89.

[8]文德学,王兴林,胡忠惠,等.滤纸石蜡油法保存淋球菌初探[J].现代医药卫生，2013,29(5):698-699.

[9]文德学,顾雪梅,王兴林等.菌种滤纸保存法的应用[J].检验医学与临床,2013,10(11):1486-1487.