肝细胞癌合并门静脉癌栓细胞的分离、培养及其特征的研究

彭榆翀陆世东谢志波庞业滨欧超黎乐群

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科；2广西医科大学研究生学院

基础研究

肝细胞癌合并门静脉癌栓细胞的分离、培养及其特征的研究

彭榆翀1，2陆世东1，2谢志波1，2庞业滨1，2欧超1黎乐群1

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科；2广西医科大学研究生学院

目的 分别选取肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）合并门静脉癌栓（portal vein tumor thrombus，PVTT）和HCC无PVTT的原发灶组织进行原代细胞分离、培养，并将培养稳定的细胞继续体外培养并行体外实验，初步对同一患者的HCC有无PVTT的特征进行研究。方法 取人HCC合并PVTT和HCC无PVTT的新鲜手术组织标本，利用酶消化法进行肿瘤细胞原代短暂培养并稳定传代。将得到稳定培养的细胞分为HCC无PVTT细胞组、HCC合并PVTT细胞组和PVTT细胞组，分别简称为HCC-PVTT（-）细胞组、HCC-PVTT（+）细胞组和PVTT细胞组。以流式细胞术检测仪检测CD90+细胞含量，采用qRT-PCR、Western blot法检测细胞培养后的HCC干细胞相关基因及其蛋白的表达。用Transwell小室检测细胞的侵袭性。结果 成功培养出原代的HCC细胞和原代PVTT细胞，并可稳定地传代。细胞表面标志物的干细胞含量、干细胞相关基因及其蛋白表达量及侵袭性均表现为PVTT细胞组>HCC-PVTT（+）细胞组，HCC-PVTT（+）细胞组>HCCPVTT（-）细胞组，差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 HCC及PVTT组织中均存在CD90+肝癌干细胞，干细胞干性越强的原发灶具有更强的侵袭和转移能力。

肝肿瘤；肿瘤干细胞；人门静脉癌栓细胞；CD90；SALL4；CK19

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的死亡率高居世界肿瘤死亡率的第三位［1］，也是我国常见恶性肿瘤之一［2］，严重威胁人类健康，但其发生的机制仍存在争议。其中，中晚期患者大多存在门静脉转移形成门静脉癌栓（portal vein tumor thrombus，PVTT），其手术切除率低，预后差。近年来肿瘤干细胞的研究受到广泛关注，研究已证实在乳腺癌［3］、结肠癌［4］、神经系统恶性肿瘤［5］等多种实体瘤中存在肿瘤干细胞。但目前分离肝癌干细胞还缺乏广谱的标志物，且绝大多数分离工作及其研究均局限于肝癌细胞系［6，7］。目前认为肝细胞癌在肝外转移的其中一个主要途径是向门静脉内生长，继而形成栓子［8］。国内外对其形成的相关机制研究尚不完善，故本实验通过体外培养人的HCC合并PVTT细胞和HCC无PVTT细胞，初步研究肝癌干细胞相关基因及其蛋白在其原发灶组织中的特性，寻找可能存在共同起源的干细胞。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织来源 实验选用的原代组织标本源于广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科收治的2012年10月至2014年1月的48例患者，其中HCC合并PVTT者22例（均为肉眼PVTT），同时成功培养出14例，分为HCC合并PVTT的原发灶细胞组和PVTT细胞组，称为HCC-PVTT（+）细胞组和PVTT细胞组。HCC无PVTT者26例，其中成功培养出6例，称为HCC-PVTT（-）细胞组。本实验征得本院医学伦理委员会批准。术前征得患者本人同意，并签署知情同意书。术后病理诊断均为肝细胞癌，伴或不伴门静脉癌栓。

1.1.2 主要仪器与试剂 细胞培养用的DMEM培养液购于美国HyClone公司，DMEM/F12+GlutaMAXTM-1、胰蛋白酶以及B-27Supplement为美国Gibco公司产品，新鲜胎牛血清及Transwell小室均购自美国Corning公司，I型胶原酶、肝素为美国Sigma公司产品，D-Hank′s液来自Solarbio，生长因子均为德国Promocell公司产品。CD90流式抗体、Matrigel基质胶及流式细胞术检测仪均来自美国BD公司。Total RNA提取试剂盒、Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix ExTaq等均购自宝生生物工程有限公司。SALL4、CD90抗体购自美国Abcam公司。羊抗兔IgG-HRP购自华安生物制品公司。

1.2 原代组织细胞的培养

分别将手术切除的新鲜HCC合并PVTT和HCC无PVTT的组织标本进行培养，剔除肉眼可见的坏死及不新鲜的组织。用D-Hank′s液充分洗涤2次，剪碎为1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm大小，加入0.5 mg/ml的Ⅰ型胶原酶溶液2ml混匀，于37℃恒温水浴振荡消化20～30min。消化恰当后，经200目细胞筛滤，在滤液中加入含10%胎牛血清的DMEM培养液混匀后，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。于沉淀物加入D-Hank′s液，吹打混匀后，以相同的速度离心5 min。除去上清液，在沉淀物中加入10%胎牛血清的含有青霉素、链霉素各100μl/m l的DMEM培养液3 ml，将细胞接种于培养皿中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。48 h更换一次培养液，待细胞长满约80%瓶底面积时按1∶2传代。

1.3 细胞表面标志物的检测

取对数生长期的细胞，消化后加1×PBS缓冲液轻轻吹打成单个细胞，加入流式细胞术检测仪专用试管，每种细胞设置一管为实验组，另一管为平行对照组。以CD90为标志在流式细胞术检测仪上机检测计数。

1.4 qRT-PCR法检测CD90、CK19、SALL4 mRNA的转录水平

设计CD90上游引物为5′-ATGAAGGTCCTCTACTTATCCGC-3′，下游引物为5′-GCACTGTGACGTTCTGGGA-3′。CK19上游引物为5′-CCGCCGTGGAAGTTTTAGTGG-3′，下游引物为5′-GGTCCGGGTCCCTGCTTCT-3′。SALL4上游引物为5′-CCAGGG-A ATGACGAGGTGG-3′，下游引物为5′-GAACTCCGCACAGCATTTCTC-3′。β-actin基因作为内参，上游引物为5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游引物为5-TGTCACGCACGATTTCC-3′。引物成品购自宝生生物工程（大连）有限公司。使用全自动荧光定量PCR仪（ABI 7500 Software v2.0.6）进行实验。反应条件为95℃30 s，95℃5 s，60℃31 s，共40个循环。测得Ct值后，数据用2-ΔΔCt法分析基因的表达倍数。

1.5 Western blot法检测CD90、SALL4蛋白的表达

严格按照说明书收集对数生长期的细胞，提取细胞总蛋白，内参蛋白选用β-actin。一抗的比例分别为1∶1 000、1∶700，二抗配制比例为1∶10 000。

1.6 细胞侵袭实验

将Matrigel混匀，用预冷的无血清DMEM培养液按1∶6稀释。制胶成功后，取对数生长期的细胞消化成单个细胞，调整细胞密度为5×105个/ml，上室加入100μl细胞悬液，下室加入600μl含10%FBS的DMEM液，置于5%CO2、37℃培养48 h后，以95%酒精固定，Giemsa染色，于倒置显微镜下拍照。实验设3个复孔，重复实验3次。

1.7 统计学分析

图1 HCC-PVTT(+)细胞培养第8代（×200）

2 结果

2.1 HCC和PVTT的细胞贴壁培养

将22例HCC合并PVTT组织的细胞分别原代培养48 h后，可见大量贴壁细胞集落。每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况，当培养至10 d左右时，细胞间的连接更加紧密，呈不规则形，折光性增强。待细胞长势稳定，一般9～14 d传一代。14例成功将同一患者原发灶细胞和门静脉癌栓细胞同时培养成功并传代，称为HCC-PVTT（+）细胞组和PVTT细胞组。选取26例HCC无PVTT的组织细胞培养，成功培养出6例，称为HCC-PVTT（-）细胞组。见图1、图2、图3。

图2 PVTT细胞原代培养的细胞岛（×200）

图3 HCC-PVTT（-）细胞培养第10代（×200）

2.2 细胞表面标志物CD90的检测结果

采用流式细胞术检测仪对HCC-PVTT（－）细胞组、HCC-PVTT（+）细胞组和PVTT细胞组进行CD90标志物检测。结果CD90+在HCC-PVTT（－）细胞组的表达为（0.74±0.081）%，在HCC-PVTT（+）细胞组中的表达为（1.91±0.032）%，PVTT细胞组中的表达为（2.09±0.080）%。CD90+在HCC-PVTT（－）细胞组和HCC-PVTT（+）细胞组的表达比较，两者差异具有统计学意义（P＜0.05）；HCC-PVTT（+）细胞组与PVTT细胞组比较差异也具有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

2.3 CD90、CK19、SALL4基因的表达量

CD90、CK19、SALL4基因的表达量在HCC-PVTT（+）细胞组相对HCC-PVTT（－）细胞组中均增加（t=－6.00，P＜0.05；t=-16.91，P＜0.05；t=-4.80，P＜0.05）。在PVTT细胞组相对HCC-PVTT（+）细胞组中3个基因的表达量也呈增加趋势（t=－3.06，P＜0.05；t=－3.753，P＜0.05；t=－3.745，P＜0.05），差异均有统计学意义。见表1。

2.4 CD90、SALL4蛋白的表达

结果显示CD90和SALL4蛋白的表达量在HCCPVTT（+）细胞组相对HCC-PVTT（－）细胞组均增加（t=－10.767、－20.066，P均＜0.05）。PVTT细胞组和HCC-PVTT（+）细胞组蛋白的表达量呈递增关系（t=－3.256、－4.370，P均＜0.05），差异均有统计学意义。见图5、表2。

2.5 细胞侵袭实验结果

比较HCC-PVTT（－）细胞组和HCC-PVTT（+）细胞组、HCC-PVTT（+）细胞组和PVTT细胞组细胞的侵袭能力。结果发现PVTT细胞比HCC-PVTT（+）细胞有更强的侵袭特性，HCC-PVTT（+）细胞的侵袭性强于HCC-PVTT（－）细胞，通过定量分析，两者差异均具有统计学意义（P均＜0.05）。见图6、图7。

图4 3个细胞组细胞表面标志物CD90检测结果

表1 3个细胞组CD90、CK19、SALL4的Ct目的基因/Ct内参基因值的比较（±s）

表1 3个细胞组CD90、CK19、SALL4的Ct目的基因/Ct内参基因值的比较（±s）

HCC-P V TT（-）细胞组和HCC-P V TT（+）细胞组比较，*P＜0.05；HCC-P V TT（+）细胞组和P V TT细胞组比较，△P＜0.05。

Ct目的基因/Ct内参基因组别CD90 CK19 SALL4 HCC-PVTT（-）细胞组 1.140±0.002 1.039±0.023 1.190±0.001 HCC-PVTT（+）细胞组 1.221±0.025*1.37±0.024*1.24±0.018*PVTT细胞组 1.29±0.03△1.44±0.015△1.31±0.02△

表2 3个细胞组CD90、SALL4蛋白的表达量比较（±s）

表2 3个细胞组CD90、SALL4蛋白的表达量比较（±s）

HCC-P V TT（-）细胞组和HCC-P V TT（+）细胞组的比较，*P＜0.05；HCC-P V TT（+）细胞组和P V TT细胞组的比较，△P＜0.05。

组别灰度值目的基因蛋白/灰度值内参基因蛋白CD90 SALL4 HCC-PVTT（-）细胞组 0.816±0.020 0.402±0.002 HCC-PVTT（+）细胞组 0.983±0.018*0.521±0.011*PVTT细胞组 1.026±0.011△0.604±0.031△

图5 3个细胞组CD90、SALL4蛋白表达的电泳图

图6 3个细胞组细胞侵袭实验（×200）

图7 3个细胞组细胞侵袭实验的定量分析

3 讨论

Michor等［9］研究认为干细胞是一小群具有自我更新、无限增殖、多向分化及成瘤潜能的肿瘤细胞，在肿瘤的发生、发展、转移、侵袭及复发中发挥着至关重要的作用。

我们选用的CD90是一种高度保守的糖蛋白［10］，分子量为（25～37）×103KD，借助甘油二酯锚定于糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）羧基端而附着于细胞膜。Yang［11］的研究指出CD90+的细胞具有高度自我更新和致瘤性，是有重要意义的肝癌干细胞标志之一。我们应用流式细胞荧光标志物CD90检测和分选HCC-PVTT（-）细胞组、HCC-PVTT（+）细胞组和PVTT细胞组中的CD90+肝癌干细胞，发现各细胞组中的CD90+的肝癌干细胞含量和各组的CD90基因和蛋白的表达呈现PVTT细胞组>HCC-PVTT（+）细胞组，HCC-PVTT（+）细胞组>HCC-PVTT（-）细胞组，由于本实验在原发灶和门静脉癌栓的细胞中均可检测出肝癌干细胞标志物CD90+的表达，可认为门静脉癌栓与原发灶以及HCC无PVTT中都存在肝癌干细胞，可能门静脉癌栓中含有与原发灶相同起源的干细胞。另外门静脉癌栓随着其转移能力的增加，CD90+肝癌干细胞含量增加，说明转移能力强可能是由于干细胞干性表达强的结果。

细胞角蛋白在人的上皮细胞系中分为22个亚型，CK19为细胞骨架蛋白的一种亚型，通常表达于胆管上皮样细胞、成熟肝细胞及HCC，是酸性角蛋白中的一种，属于Ⅰ型，它的抗原性由其含有的蛋白质多肽表达。CK19的表达与其高侵袭力存在正相关［12］。我们的侵袭实验结果也证明这一观点。在上皮细胞的恶性转化过程中，细胞角蛋白结构往往得到保持。有研究显示在肝癌中CK19可作为一个肝癌干细胞的标志物［13］。本实验表明侵袭性最强的细胞组中所含有的CK19的表达量最高，其所含有的肝癌干细胞的量最多，从而为CK19可以作为干细胞标志物提供了一定的客观依据。

另外，SALL4是一种C2H2型锌指蛋白转录因子［14］，位于人类染色体 20q13，包括 SALL4A和SALL4B两种亚型，含有4个外显子［15］。SALL4在多种实体瘤中可见异常表达［14，16，17］，近年来也被作为肝癌干细胞的标志物之一，在临床肝细胞癌的样本筛查中发现，SALL4的表达与患者3年短期生存率呈负相关［14］。本研究在以上3种干细胞相关基因及蛋白的表达中，SALL4基因及其蛋白表达量与CD90和CK19均互为正相关。说明SALL4除了可以作为肝癌干细胞的标志物外，还可能作为一个可以评价肝细胞癌转移能力的指标。

本实验结果表明门静脉癌栓的侵袭性最强，其次是HCC-PVTT（+）细胞组，再次为HCC-PVTT（－）细胞组。众所周知，临床上大多有PVTT者不仅使肝癌合并肝硬化患者门静脉高压症状恶化，从而导致肝功能衰竭［18］，甚至可引起肝细胞癌的播散和转移，进一步说明了门静脉癌栓较HCC-PVTT（+）的原发灶细胞干性强，可能由于干细胞相关特性促使门静脉癌栓较其原发灶具有更强的侵袭和转移能力及更强的自我增殖和恶性转化，从而使患者生存率下降。研究表明门静脉癌栓具有强大的侵袭性［19］，我们的侵袭性实验也证明这一点。也有研究表明，在肝癌细胞中高表达SALL4能诱使CK19高表达，下调SALL4的表达能阻碍CK19的表达［14］，说明二者存在协同性，因此SALL4也可以作为侵袭相关的指标判断预后。

我们的实验研究表明，对于同一个患者的门静脉癌栓细胞传代的间隔天数一般为8～9 d，明显短于其对应的原发灶细胞所需的13～14 d。说明可能门静脉癌栓细胞的增殖能力强于其对应的原发灶。对于HCC无PVTT的组织，其传代所需的天数为14～16 d。门静脉癌栓培养时可见生长极其旺盛的“细胞岛”样，细胞团数量较原发灶多，且多于HCC无PVTT，聚集成团的贴壁细胞岛的大小较原发灶和HCC无PVTT的细胞团块大。提示可能门静脉癌栓细胞生长旺盛，具有更强大的扩增、侵袭能力，分析可能由于干细胞在“细胞岛”中的含量较高及其干性较强所致。

综上所述，干细胞的候选标志物与其侵袭性呈正相关。高侵袭性的细胞具有更强大的干性，促使疾病预后差。鉴于目前HCC的治疗效果不理想，我们认为不能有效地杀灭对应的肿瘤干细胞，这将是治疗HCC的主要难题。后续实验将继续对肿瘤干细胞干性的强弱及其对致瘤影响进行验证，以及寻找改善HCC合并门静脉癌栓患者的预后措施，有关方面有待深入研究。

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［2014-10-08收稿］［2014-11-15修回］［编辑 阮萃才］

Isolation，culture and characterization of portal venous tumor throm bus cells from patients w ith hepatocellular carcinoma（HCC）w ith or w ithout portal vein tumor thrombosis

PENG Yuchong1，2，LU Shidong1，2，XIE Zhibo1，2，PANG Yebing1，2，OU Chao1，LILequn1（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

LILequn.E-mail：li-lequn@263.net

Objective To explore the stem cell-like properties of primary cultures of hepatocellular carcinoma（HCC）cells and portal vein tumor thrombus（PVTT）cells.M ethods Fresh hepatocellular carcinoma（HCC）with portal vein tumor thrombosisand（PVTT）or notwere used for short-term primary culture and stability batches by utilizing enzymatic digestion.We would be classify the stability of the cultured cells as HCCwithout PVTT,the T-primary tumor of HCCwith PVTT and PVTT,called section of HCC-PVTT（-）,HCCPVTT（+）and PVTT.Flow cytometry detect the content of CD90+and the expressions of relative gene and protein from HCC with PVTT or not，which were tested by qRT-PCR and Western blotmethods.Testing the cells of invasion by Transwell chamber.Results We successfully cultured primary HCC cells and PVTT cells.Flow cytometry revealed the presence of a CD90+subpopulation in both types of cultures.The different cultures varied in invasiveness as follows：PVTT cells>HCC-PVTT（+）cells>HCC-PVTT（+）cells>HCCPVTT（-）cells（P<0.05）.Conclusions Stem cell-like populations exist in HCC and PVTT tissue，and their stem cell characteristics correlate positively with tumor invasion and metastasis.

Liver neoplasm；Cancer stem cells；Portal vein tumor thrombus cells；CD90；SALL4；CK19

R735.7

A

1674-5671（2015）01-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.01.02

国家自然科学基金资助项目（81160262）

黎乐群。E-mail：li-lequn@263.net