RhoGDI2基因抑制膀胱癌转移涉及基因和信号通路的生物信息学分析

唐勇李秀宁高超刘翰楠王琪

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院泌尿外科；2广西医科大学研究生学院；3广西肿瘤防治研究所实验研究部；4区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室（广西医科大学）

基础研究

RhoGDI2基因抑制膀胱癌转移涉及基因和信号通路的生物信息学分析

唐勇1李秀宁2高超1刘翰楠1王琪3，4

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院泌尿外科；2广西医科大学研究生学院；3广西肿瘤防治研究所实验研究部；4区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室（广西医科大学）

目的 利用生物信息学方法探讨RhoGTP酶GDP解离抑制因子2（rho GDP dissociation inhibitor 2，RhoGDI2）基因抑制膀胱癌转移涉及的基因和信号通路。方法 从GEO datasets数据库搜索膀胱癌转移相关的全基因组表达谱芯片数据，使用GEO2R在线工具分析膀胱癌组织中RhoGDI2基因高表达组与低表达组之间的差异表达基因，再筛选出多组表达谱芯片数据中一致性上调或下调的基因，最后使用DAVID在线工具进行差异表达基因信号通路富集。结果 得到RhoGDI2基因在膀胱癌组织中高表达组和低表达组一致性高的差异表达基因，其中A2M、CORO1A、ENC1、FGD3为上调基因中一致性高的差异表达基因。通过基因信号通路富集分析得到膀胱癌组织中RhoGDI2基因调控的主要信号通路为Vav-RhoA-ROCK-MLC和Ras-Raf-MEK。结论 RhoGDI2基因可能通过Vav-RhoA-ROCK-MLC和Ras-Raf-MEK信号通路调节肌丝蛋白、细胞骨架以及细胞的增殖、分化等，进而抑制膀胱癌转移。

膀胱肿瘤；RhoGTP酶GDP解离抑制因子2；基因；信号通路；生物信息学

RhoGTP酶GDP解离抑制因子2（rho GDP dissociation inhibitor 2，RhoGDI2）是RhoGTP酶的GDP解离抑制因子家族成员之一，主要功能是调节RhoGTP酶活性状态的Rho-GTP和非活性状态的Rho-GDP之间的循环［1］。在不同类型的肿瘤中，RhoGDI2基因的表达可上调或下调，如在卵巢癌、胃癌中的表达上调，在膀胱癌中的表达下调［2.3］。有研究发现，RhoGDI2基因与膀胱癌侵袭和转移相关，其表达随膀胱癌临床分期升高而下降，在非肌层浸润型膀胱癌中的表达高于肌层浸润型，在非转移型膀胱癌中的表达高于转移型［4，5］。在膀胱癌动物模型中也发现高表达RhoGDI2基因能够抑制膀胱癌的浸润和转移。

生物信息学是近年来非常热门的研究工具，广泛应用于分子生物学各个领域，包括基因组序列信息和基因表达谱的分析、蛋白质序列和结构及相互作用分析、代谢和疾病发生途径的信号通路研究等［6，7］。本文采用生物信息学方法，挖掘RhoGDI2基因水平的信号通路和共同表达基因，探讨RhoGDI2基因在膀胱癌转移中的作用机制。

1 方法

1.1 数据库检索

在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中检索膀胱癌转移相关的全基因组表达谱芯片数据。检索关键词为膀胱癌（bladder cancer）。检索条件如下：种属为人类（homo sapiens）；芯片类型为表达谱芯片（expression profiling by array）。使用以下纳入标准对检索结果进行筛选：⑴必须是全基因组表达芯片；⑵样本为膀胱癌组织；⑶同一基因芯片系列样本中包含至少20例膀胱癌组织样本；⑷样本的患者未经放化疗。剔除每个基因芯片系列中正常对照或者癌旁样本的芯片数据，以膀胱癌样本的芯片数据作为研究对象。按照ARHGDIB基因（即RhoGDI2基因官方标注名称）表达值的高低将芯片数据从高到低排序，ARHGDIB基因表达值最高和最低各10张芯片，分别作为RhoGDI2基因高表达组和低表达组。

1.2 差异表达基因的筛选

利用GEO2R在线工具（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/geo/info/geo2r.html）分析膀胱癌组织中RhoGDI2基因高表达组和低表达组之间的差异表达基因。按以下标准筛选差异表达基因：⑴剔除基因表达值改变在1.5倍以上的芯片数据少于20%的基因；⑵剔除基因表达数据缺失值超过50%的基因。分析RhoGDI2基因高表达组和低表达组间差异表达基因以及一致性表达上调或下调的基因。

1.3 差异表达基因信号通路的富集

用PATHER在线工具（http：//www.pantherdb.org/）分析各个差异表达基因基因本体的细胞成分、分子功能和生物学过程。用DAVID在线工具进行KEGG差异表达基因信号通路的富集分析，综合比对各组差异表达基因集的KEGG信号通路，选择一致性高的信号通路进行具体分析。

2 结果

2.1 基因芯片数据的筛选

在NCBI的GEO datasets数据库中找到符合纳入标准的6套数据，共计685例膀胱癌组织的全基因组表达谱芯片数据，具体信息见表1。

2.2 多个基因芯片系列间差异表达基因的筛选

分析符合纳入标准的6套数据，得到各套数据差异表达基因中上调和下调基因的数目（表2），对其进行交叉比对，在ARHGDIB基因表达上调的膀胱癌样本中，A2M、CORO1A、ENC1、FGD3基因在5套基因芯片系列中的表达均升高，在下调的差异表达基因中，RAP1GDS1、RPRD1A基因在4个基因芯片系列中的表达均下降。

用PATHER在线工具分析 A2M、CORO1A、ENC1、FGD3基因本体的细胞成分、分子功能和生物学过程。这4个基因涉及的细胞成分主要包括：细胞骨架和鸟嘌呤核苷酸交换因子GEF；分子功能包括：细胞骨架的调节，肌丝蛋白结合活性及催化酶、肽酶、GTP酶、细胞因子的活性调节等；生物学过程主要包括：细胞活动及代谢过程，细胞骨架的形成及发展过程等。总的来说，上调的这4个基因主要涉及细胞运动和RhoGTP酶活性的调节。

2.3 差异表达基因信号通路富集结果

将6个基因芯片系列的差异表达基因分别导入DAVID在线工具进行信号通路富集分析，得到该差异表达基因集上调和下调基因主要集中的KEGG通路，将这些信号通路集进行比对，得到一致性高的共同信号通路。上调的差异表达基因主要富集在白细胞穿过内皮迁移、病毒性心肌炎、细胞黏附分子、小细胞肺癌等共同相关功能和疾病的信号通路。见表3。而下调的差异表达基因主要富集在缬氨酸/亮氨酸和异亮氨酸降解、阿尔茨海默病等共同相关功能和疾病的信号通路。见表4。

表1 符合纳入标准的膀胱癌组织全基因组表达谱芯片系列信息

表2 6套膀胱癌基因芯片系列差异表达基因数目（个）

表4 KEGG通路分析下调的差异表达基因共同相关功能与疾病的信号通路

表3 KEGG通路分析上调的差异表达基因共同相关功能和疾病的信号通路

3 讨论

本研究应用生物信息学的方法探讨RhoGDI2基因在抑制膀胱癌转移中涉及的基因和信号通路。首先筛选出膀胱癌组织中RhoGDI2基因高表达组与低表达组之间的差异表达基因，然后对差异表达基因进行比对和信号通路富集分析，发现上调的差异表达基因主要富集在白细胞穿过内皮迁移、病毒性心肌炎、细胞黏附分子、小细胞肺癌等共同相关功能和疾病的信号通路。肿瘤的转移过程包括肿瘤细胞与原发病灶黏附力下降、细胞外基质降解、肿瘤细胞迁移和穿越血管内皮运动等，在肿瘤细胞转移过程中机体会产生免疫反应。RhoGDI2基因可能通过以上的信号通路影响肿瘤转移过程的各个环节。

Rho家族蛋白是G蛋白偶联的Ras超家族成员［8］。RhoGDI2基因调节RhoGTP酶活性状态的过程主要涉及三类分子：鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs），GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）和GDP解离抑制因子（GDP dissociation inhibitors，GDIs）［9］。RhoGDI2基因可以通过信号通路中的RhoGDI2酶（主要是Rho、Rac、Cdc42）或者Ras发挥作用。本文研究结果显示，上调的差异表达基因主要富集的共同相关功能和疾病的信号通路中有8条涉及RhoGTP酶或Ras蛋白。

这8条共同相关功能和疾病的信号通路具体如下：⑴在穿越血管内皮运动中，有调节肌丝蛋白的Vav-RhoA-ROCK-MLC信号通路和调节细胞运动的PI3KVav-Cdc42/Rac1/Rac2信号通路，调控节点为Vav。同时还有RhoGAP-RhoA-ROCK-MLC肌丝蛋白/肌动蛋白调节通路，调控节点为RhoA。⑵在血管平滑肌收缩功能中，有Gα12/13-RhoGEF-RhoA-ROCK-MLC/MHC血管收缩信号通路，调控节点为ROCK。⑶在黏着斑相关信号通路中，有ECM与受体相互作用-PKC/SRCFAK-RhoGAP/RhoGEF-RhoA-ROCK-MLC/mDia1的肌丝蛋白调节通路和FAK-P13K-PIP3-Rac/Cdc42-PAK的肌丝蛋白和细胞增殖调节通路，调控节点为信号通路上游的FAK、Src和下游的RhoA、PAK、MLC。⑷在T细胞受体信号通路中，有调控免疫反应、细胞增殖、分 化功能 的 MHC-ZAP70-SOS-RasGRP1-Ras-Raf-MEK-AP1信号通路，调控节点为ZAP70。⑸在B细胞受体信号通路中，有调节肌丝蛋白骨架的LYN-BTKBLNK-Vav-Rac信号通路，调控节点为BLNK、BTK；还有调节免疫产物表达和B细胞活化的BLNKRasGRP3-Ras-Raf-MEK-AP1-IG信号通路，调控节点为BLNK、RasGRP3。⑹在FcγR介导的吞噬作用中，有调节肌丝骨架的抗原-IgG-Syk-Vav-Rac-PAK1信号通路，调控节点为Syk、Rac。⑺在肌丝蛋白细胞骨架调节通路中，有趋化因子-Ras-Raf-MEK-ROCK-MLC和趋化因子-Ras-PI3K/Rac1GEF-Rac-Cdc42信号通路，还有与肌丝蛋白聚合功能及基因表达相关的趋化因子-RhoGEF-Rho-ROCK-MLC信号通路，其中最重要调控节点为Rac、ROCK，其次是Rho。⑻在肿瘤信号通路中调控细胞增殖运动的有细胞因子与受体相互作用-Ras-Raf-MEK-MAPK信号通路，其中重要调控节点为Ras；还有调控组织侵袭和转移功能的Thrombin-RhoGEF-Rho-ROCK信号通路，其中重要调控节点为Rho。

以上信号通路中Rho、Rac、Cdc42是多个信号通路的调控节点，影响细胞的多种功能。这些信号通路的终端效应与肿瘤细胞转移过程的细胞运动、机体免疫等密切相关。其中以调节肌丝蛋白功能的Vav-RhoA-ROCK-MLC信号通路最为常见，其次为Ras-Raf-MEK信号通路。关键调控节点一致性较高的下游因子有ROCK、mDia1、PAK、MEK、AP1、MLC等，一致性较高的上游因子主要有 Vav、FAK、Src、P13K、PIP3等。

对信号通路中关键调控节点一致性较高的下游因子和上游因子进行分析。Rho激酶（Rho associated kinases，ROCK）是Rho蛋白的主要效应分子，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶［10］，可磷酸化激活，其表达升高与膀胱癌转移呈正相关［11］。mDia1属于成蛋白（formin）相关蛋白家族，可通过集结和聚合作用生成肌丝，同时作为Rho介导的肌丝骨架调节通路的下游因子，可能参与Src介导的肿瘤细胞迁移和黏着斑重塑［11］。p21激酶（p21-activated kinase，PAK）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可结合并促进RhoGDI2磷酸化，其活性受Rac和Cdc42及其他因子调节。Rac1的激活对PAK诱导RhoGDI2磷酸化起正反馈作用，并与细胞迁移相关［12］。丝裂原细胞外激酶（mitogen extracellular kinase，MEK）在Ras-Raf-MEK-ERK信号通路中发挥重要作用，在膀胱癌中可通过Ras-MAPK信号通路影响膀胱癌的发生、侵袭和转移［13］。激活蛋白-1（activating protein-1，AP1）是由原癌基因Fos和Jun蛋白组成的异源二聚体，构成亮氨酸拉链［14］。AP1调节靶基因的表达可以产生细胞增殖、分化、炎症、宿主反应和恶变等效应，而AP1活性降低可影响抑癌基因p53及细胞周期调控基因p21的表达，p53和p21基因表达的下降使细胞生长及增殖受到抑制、细胞凋亡［15］。肌球蛋白调节轻链（myosin light-chain，MLC）是肌丝蛋白调节的中间环节。Vav属于GEFs之一，主要功能是调节RhoGTP酶的活化，在肿瘤生成中发挥重要作用［16］。聚集黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK）是整合蛋白介导的信号传导过程中的关键酶，与细胞恶变、分化、浸润相关，在膀胱癌癌组织中的表达显著高于癌旁组织，在浸润性癌中的表达阳性率明显高于非浸润性癌，FAK的表达升高有助于膀胱癌细胞的增殖和迁移［17］。P13K是细胞内重要的信号传导分子，P13K激活PIP3，进一步引起下游效应因子活化。

在膀胱癌中关于RhoGDI2基因与Rac1、Src相关关系的研究较多。RhoGDI2特异性结合Rac1，以不同肿瘤类型依赖的方式正向/负向调节其活性，进而调节肿瘤的侵袭和转移能力。Rac1的活性增加与抑制膀胱癌转移相关［18］。Src能与RhoGDI2结合，磷酸化RhoGDI2的特定酪氨酸残基。磷酸化后的RhoGDI2与RhoA、Rac1和Cdc42结合能力减弱，抑制膀胱癌转移的功能受到影响［19］。Src的表达与膀胱癌分期和RhoGDI2基因的表达均呈负相关，提示二者可能涉及相同的信号传导通路［20］。

本研究结果提示RhoGDI2基因在膀胱癌的转移中可能通过Vav-RhoA-ROCK-MLC和Ras-Raf-MEK等信号通路发挥作用，这些信号通路主要参与调节肌丝蛋白和细胞骨架以及细胞的增殖、分化等。有关方面仍需进一步实验验证。

［1］ D ov a s A，C o uchman J R.R h o G D I：mu lt ip l e f unc t i o n s in t he r egu l a t i o n of R h o f ami l y G T P a s e ac t i v i t ie s［J］.B i o chem J，2005，390（Pt1）：1-9.

［2］ C h o H J，B ea k KE，P a rk S M，e t a1.R h o G D l2 e x p r e ss i o n i s a sso cia t e d w i t h t um or g ro u t h an d ma l ignan t p ro g r e ss i o n of ga str ic cance r［J］. C l in C ance r R e s，2009，15（8）：2612-2619．

［3］ T appe r J，K e tt unen E，E l-R i f ai W，e t a l.C hange s in gene e x p r e ss i o n d u r ing p ro g r e ss i o n of ov a r ian ca r cin o ma［J］.C ance r Gene t C y to gene t 128（1）：1-6.

［4］ Gi ld ea JJ，S e r a j M J，O x ford G，e t a l.R h o G D12 i s an in v a s i o n an d me t a st a s i s s upp r e ssor gene in human cance r［J］.C ance r R e s，2002，62（22）：6418-6423.

［5］ St e v en s E V，B ane t N，O ne sto C，e t a l.R h o G D I2 an t ag o ni z e s ov a r ian ca r cin o ma g rowt h，in v a s i o n an d me t a st a s i s［J］.S ma ll G T P a s e s，2011，2（4）：202-210.

［6］ 陈昌贤.卵巢上皮癌多药耐药分子机制生物信息学研究［D］.南宁：广西医科大学，2013.

［7］ 蔡祖艾，王琪，张玮，等.以基因通路富集法探索上皮性卵巢癌多药耐药相关生物学通路及功能性S N P位点［J］.中国癌症防治杂志，2014，6（2）：127-132.

［8］ O x ford G，T he odor e s cu D.R a s s upe rf ami l y m o n o me r ic G p rot ein s in ca r cin o ma ce ll m ot i l i t y［J］.C ance r L e tt，2003，189（2）：117-128.

［9］ S chmi dt A，H a ll A.Guanine nuc l e ot i d e e x change f ac tors for R h o G TP a s e s：t u r ning o n t he sw i t ch［J］.Gene s D e v，2002，16（13）：1587-1609.

［10］ A man o M，N a k ayama M，K ai b uchi K.R h o-k ina s e/RO CK：A k ey r egu l a tor of t he cy tosk e l e to n an d ce ll p ol a r i t y［J］.C y tosk e l e to n（H obok en），2010，67（9）：545-554.

［11］N a r umiya S，T an j i M，I s hi z a k i T.R h o s igna l ing，RO CK an d m D ia1，in tr an sfor ma t i o n，me t a st a s i s an d in v a s i o n［J］.C ance r M e t a st a s i s R e v，2009，28（1-2）：65-76.

［12］D e r M a rd i ross ian CM，B oko ch G M.P h os ph or y l a t i o n of R h o G D I b y p21-ac t i v a t e d k ina s e 1［J］.M e t h ods E n z ym ol，2006，406：80-90.

［13］夏炎枝.T E R E1/U BIA D1抑制膀胱癌的分子机制研究及T E R E1/ U BIA D1的结构与功能分析［D］.武汉：华中科技大学，2010.

［14］H e rb ein G，V a r in A，F u lo p T.NF-k appa B，A P-1，Z inc-d e f iciency an d aging［J］.B i o ge ro n tolo gy，2006，7（5-6）：409-419.

［15］杨振兴.A n t ip rol i f e r a t i v e F ac tor对人尿路上皮癌T-24细胞株的增殖和C-J U N表达研究［D］.辽宁：中国医科大学，2009.

［16］Lópe z-L ag o M，L ee H，C r u z C，e t a l.T y ros ine ph os ph or y l a t i o nme d ia t e s bot h ac t i v a t i o n an d dow nm od u l a t i o n of t he b i olo gica l ac t i v i t y of V a v［J］. M ol C e ll B i ol，2000，20（5）：1678-1691.

［17］刘光明，马洪顺，孙光.P T E N、F AK在膀胱移行细胞癌中的表达［J］.现代泌尿外科杂志，2009，14（2）：114-117.

［18］S un D，X u D，Z hang B.R ac s igna l ing in t um or igene s i s an d a s t a r ge t for an t icance r dr ug d e v e lo pmen t［J］.D r ug R e s i st Up d a t，2006，9（6）：274-287.

［19］D e r M a rd i ross ian C，R o c kl in G，S e o J Y e t a l.P h os ph or y l a t i o n of R h o G D I b y Sr c r egu l a t e s R h o G T P a s e b in d ing an d cy tosol-mem br ane cyc l ing［J］. M ol B i ol C e ll，2006，17（11）：4760-4768.

［20］W u Y，M o i sso g l u K，W ang H，e t a l.Sr c ph os ph or y l a t i o n of R h o G D I2 r egu l a t e s i ts me t a st a s i s s upp r e ssor f unc t i o n［J］.Pro c N a tl A ca d S ci U S A，2009，106（14）：5807-5812.

［2014-12-19收稿］［2015-01-28修回］［编辑 游雪梅］

Bioinformatic analysis of genes and signaling pathways associated w ith RhoGDI2-inhibited bladder cancer metastasis

TANG Yong1，LIXiuning2，GAO Chao1，LIU Hannan1，WANG Qi3，4（1Department of Urology Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University；3Research Department of Guangxi Cancer Institute；4Key Laboratory of High-Incidence-Tumor Prevention Treatment（Guangxi Medical University），Ministry of Education，Nanning 530021，P.R.China）

WANG Qi.E-mail：qi_catcat@163.com

Objective This study used bioinformatics to examine the genes and signaling pathways associated with RhoGDP dissociation inhibitor 2（RhoGDI2）inhibits bladder cancermetastasis.M ethods Six datasets from genomic microarray studies of patients with metastatic bladder cancer were downloaded from the Gene Expression Omnibus database.On-line GEO2R tools were used to screen for genes differentially expressed between individuals expressing low or high levels of RhoGDI2.On-line DAVID tools were used to map differentially expressed genes to signaling pathways.Result The genes A2M，CORO1A，ENC1，and FGD3 were expressed at higher levels in patients expressing high levels of RhoGDI2.RhoGDI2 appeared to influence the RhoA-ROCK-MLC and Ras-Raf-MEK signaling pathways to the greatest extent.Conclusion RhoGDI2 may act via the RhoA-ROCK-MLC and Ras-Raf-MEKpathways to regulate cytoskeleton，cell proliferation，differentiation and metastasis in bladder cancer.

Bladder neoplasm；Rho GDP dissociation inhibitor 2；Gene；Signaling pathways；Bioinformatics

R737.14

A

1674-5671（2015）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.01.04

国家自然科学基金资助项目（81360341）；广西自然科学基金资助项目（2011GXNSFC018020,2012GXNSFAA053163）

王琪。E-mail：qi_catcat@163.com

李秀宁为共同第一作者。