EM L4-ALK融合基因阳性表达的人肺腺癌H 2228细胞对克唑替尼耐药后BIM信号通路的影响

韦江彭海燕苏翠云宋向群王惠临宁瑞玲周韶璋

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院化疗二科；2广西医科大学研究生学院

基础研究

EM L4-ALK融合基因阳性表达的人肺腺癌H 2228细胞对克唑替尼耐药后BIM信号通路的影响

韦江1，2彭海燕1，2苏翠云1宋向群1王惠临1宁瑞玲1周韶璋1

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院化疗二科；2广西医科大学研究生学院

目的 建立人肺腺癌H2228克唑替尼耐药细胞株，探讨克唑替尼（crizotinib）诱导EML4-ALK融合基因阳性表达的人肺腺癌细胞H2228在BIM信号通路中的作用。方法 克唑替尼按50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L的浓度逐步递增法诱导人肺腺癌H2228细胞株获得性耐药；分别采用MTT法和流式细胞术检测H2228和H2228/CR细胞在不同浓度克唑替尼作用后的IC50和细胞凋亡率；采用Western blot法检测H2228和H2228/CR细胞在BIM信号通路关键分子ALK、p-ALK、ERK、p-ERK及BIM蛋白表达的变化。结果 成功诱导克唑替尼耐药细胞株H2228/CR；MTT法检测H2228/CR细胞和H2228细胞的IC50分别为3 418 nmol/L、335 nmol/L，H2228/CR细胞的耐药指数为10.20，H2228/CR细胞在不同浓度克唑替尼作用下的增殖抑制率低于H2228细胞（P＜0.05）；流式细胞术检测显示克唑替尼对H2228细胞有促凋亡作用，且呈时间依赖性（P＜0.05），H2228/CR细胞的凋亡率明显低于H2228细胞的凋亡率（P＜0.05）；Western blot法检测显示H2228/CR细胞的p-ALK、p-ERK的表达不受抑制，BIM蛋白表达无上调趋势。结论 实验表明H2228/CR耐药细胞中的BIM蛋白的表达与其耐药有关。初步阐明EML4-ALK阳性表达的非小细胞肺癌克唑替尼耐药产生的可能机制，BIM在诱导EML4-ALK阳性表达的人肺腺癌细胞株H2228对克唑替尼产生耐药发挥重要作用，提示BIM可作为克服克唑替尼耐药的一个靶点。

肺肿瘤；EML4-ALK融合基因；H2228细胞；克唑替尼；获得性耐药；BIM

肺癌已成为致死率最高的癌症之一。目前晚期非小细胞肺癌的治疗方式主要是传统化疗，但其疗效并不理想。近年来，分子靶向治疗已成为肺癌研究的热点，克唑替尼是针对ALK/c-Met双靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂，与位于细胞膜内侧的酪氨酸激酶ATP结合域竞争性相结合，通过阻断该通路的信号传导来实现细胞的生长抑制和促进凋亡［1］，其在治疗含EML4-ALK的非小细胞肺癌已取得显著疗效［2］，然而在一段时间治疗后不可避免地出现耐药［3］。BIM作为促凋亡家族成员之一，现已证实在肿瘤细胞耐药中发挥重要作用［4］。本研究通过建立含有ALK融合基因的耐药细胞株H2228/CR，观察ALK下游BIM基因的变化，以探讨H2228细胞在克唑替尼耐药前后BIM信号通路的变化。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人非小细胞肺腺癌细胞H2228购于美国ATCC公司。

1.2 主要试剂与仪器

克唑替尼粉末制剂购于美国Selleckchem公司，RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清、胰蛋白酶替代物购自美国Gibco公司，MTT购自美国Amresco公司，Western blot仪器设备购于美国Bio-Rad公司，ALKⅠ抗、p-ALKⅠ抗，ERKⅠ抗、p-ERKⅠ抗/BIMⅠ抗以及荧光Ⅱ抗均购自美国Cell Signaling公司，BCA试剂盒购自美国Merck公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及建立耐药细胞株 H2228耐药细胞株的诱导采用克唑替尼浓度递增的方法。购于ATCC公司的人非小细胞肺腺癌细胞株H2228利用二甲基亚砜（DMSO）冷冻保存，细胞复苏采用快速融化法，迅速放入38℃水浴中，1min内使其完全融化，离心弃去上清液，细胞在37℃、5%CO2条件下培养于10%胎牛血清及RPMI-1640培养基中。H2228细胞在含有50 nm/L克唑替尼的培养基中孵育，每72 h换一次培养液；细胞长至80%培养瓶后传代，继续孵育在含有50 nm/L克唑替尼的培养基，待细胞稳定生长后将克唑替尼浓度增加至100 nm/L继续培养，细胞稳定生长后增加克唑替尼浓度至200 nm/L继续培养，依次不断增加克唑替尼的浓度，直到H2228细胞在1 000 nmol/L克唑替尼浓度下稳定生长传代，诱导时间为8个月，诱导耐药细胞株命名为H2228/CR。

1.3.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 将处于对数生长期的H2228和H2228/CR细胞按（6～10）×103个/孔的细胞密度接种到96孔板，设6个浓度，每个浓度设4个复孔，待细胞生长贴壁后，按浓度梯度法加入含不同浓度的克唑替尼培养液，把细胞置于培养箱中继续孵育72 h后，吸去孔内液体，每孔加入MTT液继续孵育4 h后再加入DMSO，充分振荡10min，在492 nm波长下测量吸光度值，计算出克唑替尼对H2228/CR及H2228细胞的IC50，耐药指数（resistance index，RI）=H2228/CR细胞IC50/H2228细胞IC50。实验重复3次。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取生长状态良好的对数生长期H2228细胞与H2228/CR细胞，以4×105个/孔、5×105个/孔、7×105个/孔的细胞分别接种于6孔板中（其中H2228、H2228/CR各接种8个孔），培养24 h，H2228和H2228/CR细胞加入克唑替尼浓度为300 nmol/L血清培养液，分别将4×105个/孔接种的细胞培养72 h，5×105个/孔接种的细胞培养48 h，7×105个/孔接种的细胞培养24 h，以细胞凋亡试剂盒说明书的操作收集细胞并染色，用流式细胞术检测仪测定细胞凋亡率。实验重复3次。

1.3.4 Western blot法检测克唑替尼对H2228细胞耐药前后ALK、p-ALK、ERK、p-ERK、BIM蛋白表达的影响 收集长满培养瓶的H2228细胞和H2228/CR细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，所得总蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，ALKⅠ抗稀释度为1∶1 000，p-ALKⅠ抗稀释度为1∶1 500，BIMⅠ抗稀释度为1∶1 000，兔ERKⅠ抗稀释度为1∶1 000，p-ERKⅠ抗稀释度为1∶1 000，鼠Ⅱ抗稀释度为1∶2 000，兔Ⅱ抗稀释度为1∶2 000。以肌动蛋白（β-actin）作为内参照。红外荧光Ⅱ抗（DyLight 680 conjugate）显色，扫描分析条带，以条带灰度确定蛋白表达。实验重复3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据处理和分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组数据的比较采用t检验，多组数据的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色法检测克唑替尼对 H2228细胞和H2228/CR细胞增殖抑制的影响

采用克唑替尼浓度递增方法，经过8个月诱导，成功建立克唑替尼耐药细胞株H2228/CR。MTT法检测结果显示克唑替尼对H2228细胞和H2228/CR细胞的IC50分别为335 nmol/L和3 418 nmol/L，H2228/CR细胞的耐药指数为10.20。H2228/CR细胞在不同浓度克唑替尼作用下的细胞增殖抑制率低于H2228细胞（P<0.05）。见表1。

表1 不同浓度的克唑替尼处理H 2228细胞和H 2228/CR细胞72 h后细胞增殖抑制率的比较（±s）

表1 不同浓度的克唑替尼处理H 2228细胞和H 2228/CR细胞72 h后细胞增殖抑制率的比较（±s）

克唑替尼浓度（nmol/L）细胞株30 90 270 810 H2228/CR 4.15±0.20 6.93±1.41 13.26±1.05 22.39±1.65 H2228 10.62±0.56 22.11±1.06 29.30±1.21 80.40±1.24 t -16.525 54.203 14.435 38.260 P 0.004 <0.001 0.005 0.001

2.2 流式细胞术检测克唑替尼对 H2228细胞和H2228/CR细胞凋亡的影响

根据MTT法检测H2228细胞生长的情况，选用300 nmol/L克唑替尼以不同培养时间（24 h、48 h、72 h）处理 H2228细胞和 H2228/CR细胞，检测其细胞凋亡率。结果H2228细胞凋亡率分别为（19.17±0.63）%、（28.18±1.49）%、（43.54±3.18）%；H2228/CR细胞凋亡率分别为（3.33±0.17）%、（6.31±1.62）%、（9.50±1.32）%。结果显示克唑替尼对H2228细胞有促凋亡作用，且具有时间依赖性（P<0.05）；H2228/CR细胞的凋亡率明显低于H2228细胞（P＜0.05）。说明H2228/CR细胞对克唑替尼产生耐药。见图1、图2。

图1 克唑替尼（300 nmol/L）对H 2228细胞和H 2228/CR细胞不同时间点的细胞凋亡流式图

图2 克唑替尼（300 nmol/L）对H2228细胞和H2228/CR细胞不同时间点的细胞凋亡率的影响

2.3 Western blot法检测ALK、p-ALK、ERK、p-ERK、BIM蛋白的表达水平

结果显示，在H2228/CR细胞中随着克唑替尼浓度增加，p-ALK、p-ERK蛋白的表达不受抑制，BIM蛋白的表达无上调趋势。而在H2228细胞中，p-ALK、p-ERK蛋白的表达呈下降趋势，BIM的三个异构体Bim-s、Bim-L、Bim-exL的表达逐渐上调。见图3。

图3 克唑替尼（300 nmol/L、1 000 nm ol/L）对H 2228细胞和H 2228/CR细胞培养72 h后的W estern blot法检测结果

3 讨论

非小细胞肺癌的靶向治疗已成为近年来研究的热点，EML4-ALK融合基因阳性的非小细胞肺癌作为近期发现的一种新的肺癌亚型，其在肺癌中的发生率为3%～7%［5］。包括克唑替尼在内的以EML4-ALK为靶点的分子靶向药物，在治疗含有ALK融合基因的肺癌患者中取得较好的疗效，但一部分患者产生获得性耐药。目前对于克唑替尼耐药机制尚未完全阐明，有文献报道如基因二次突变（C1156、L1196等）、表皮向间质转化等都能引起耐药的发生［6，7］。本研究通过克唑替尼浓度递增法建立H2228/CR耐药细胞株，以MTT法计算H2228/CR的耐药指数为10.20，从而为后续耐药机制的研究奠定了良好基础。

BIM作为一种促凋亡因子，是bcl-2家族中HB3 only亚家族的成员［8］。其促凋亡作用主要与抗凋亡家族成员如bcl-2、bcl-xL相结合形成二聚体或多聚体的形式，在线粒体膜上引起细胞色素C释放，从而导致细胞死亡［9］。BIM在稳定造血细胞的内环境、调节免疫系统、肿瘤的发生等发挥关键作用［10］。我们的研究发现克唑替尼对H2228细胞有诱导凋亡作用，且呈时间依赖性。以克唑替尼作用72 h后检测H2228细胞中ALK、ERK的活化形式p-ALK、p-ERK蛋白的表达量下降，并随克唑替尼浓度增加呈下降趋势，而BIM蛋白的表达量增加。我们推测克唑替尼对H2228细胞的促凋亡作用与MAPK/MEK/ERK信号通路有密切关系。现已知活化的ERK通过磷酸化Bim-exL的Ser导致BIM被蛋白酶体降解，引起BIM表达水平下调［11］。本实验结果显示H2228细胞p-ERK蛋白表达下调时，BIM蛋白表达量增加。由此说明克唑替尼通过抑制ALK磷酸化来抑制下游信号通路MAPK/ MEK/ERK的激活来上调BIM蛋白的表达，从而促进H2228细胞凋亡，这与Luciano等［11］的研究一致。

在获得H2228/CR耐药细胞后发现克唑替尼对其不具有诱导凋亡的作用，而且活化的p-ALK表达未受到抑制，下游通路中的p-ERK蛋白表达未见下降，促凋亡蛋白BIM未见上调。目前引起克唑替尼耐药机制主要有ALK激酶区域突变、信号传导旁路的激活、ALK融合基因拷贝数目的增加等［12］。现公认的耐药机制是激酶区域ATP结合位点的突变［13］，这可能是本实验中导致H2228细胞耐药的原因。Katayama等［14］研究发现在ALK融合基因肺癌细胞中ATP结构域的gatekeeper处检测到L1196M突变，使ALK空间构象发生改变阻止克唑替尼结合。本实验中p-ALK持续活化可能是由于ALK激酶区突变阻碍克唑替尼与ALK结合导致，从而激活下游通路，抑制促凋亡蛋白BIM的增加。Song等［15］通过对表皮生长因子受体（EGFR）突变的肺腺癌耐药细胞株研究发现，单独使用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）时，下游通路MAPK/MEK/ ERK仍能再次被激活，说明下游信号传导可能绕过EGFR靶点向下传导产生耐药。另外，Ng等［16］研究证实BIM基因缺失多态性与吉非替尼耐药有关，在EGFR基因突变患者中，有BIM基因多态性患者对吉非替尼的疗效较无BIM多态性者差。这些耐药机制是否与本实验有关还需进一步研究。

本研究表明，BIM在诱导EML4-ALK阳性表达的人肺腺癌细胞株H2228对克唑替尼产生耐药发挥重要作用，阐明了EML4-ALK阳性表达的非小细胞肺癌克唑替尼耐药产生的可能机制，提示BIM可作为克服克唑替尼耐药的一个靶点，为未来逆转耐药提供了新的思路。本实验存在一些不足之处，有待今后研究进一步完善，如利用基因干扰技术抑制BIM基因蛋白的表达，以同样条件的克唑替尼处理沉默BIM基因前后的H2228细胞，检测细胞凋亡情况，以进一步阐明BIM在H2228/CR耐药细胞中的作用。有关方面有待深入研究。

［1］ K w a k EL，B ang Y J，C ami d ge DR，e t a l.A nap l a st ic l ymph o ma k ina s e inhi b i t i o n in n o n-s ma ll-ce ll l ung cance r［J］.N E ng l J M e d，2010，363（18）：1693-1703.

［2］ Gan d hi L，Jänne P A.C r i zot ini b for ALK-r ea rr ange d n o n-s ma ll ce ll l ung cance r：a ne w t a r ge t e d t he r apy for a ne w t a r ge t［J］.C l in C ance r R e s，2012，18（14）：3737-3742.

［3］ H euc k mann J M，H olz e l M，Sos ML，e t a l.ALK mu t a t i o n s c o n f e rr ing d i ff e r en t ia l r e s i st ance to str uc t u r a ll y d i v e rs e ALK inhi b i tors［J］.C l in C ance r R e s，2011，17（23）：7394-7401.

［4］ X i o ng H，W ang J，Guan H，e t a l.S ph K1 c o n f e rs r e s i st ance to ap o ptos i s in ga str ic cance r ce lls b y dow n r egu l a t ing B im v ia st imu l a t ing A kt/F o x O3a s igna l ing［J］.O nc ol R ep，2014，32（4）：1369-1373.

［5］ H or n L，P a oW.EML4-ALK：h o ning in o n a ne w t a r ge t in n o n-s ma llce ll l ung cance r［J］.J C l in O nc ol，2009，27（26）：4232-4235.

［6］ K im H R，K im WS，C h o i Y J，e t a l.E pi t he l ia l-me s enchyma l tr an s i t i o n l ea ds to c r i zot ini b r e s i st ance in H2228 l ung cance r ce llsw i t h EML4-ALK tr an slo ca t i o n［J］.M ol O nc ol，2013，7（6）：1093-1102.

［7］Z hang S，W ang F，K ea ts J，e t a l.C r i zot ini b-r e s i st an t mu t an ts of EML4-ALK i d en t i f ie d t h ro ugh an acce l e r a t e d mu t agene s i s s c r een［J］.C hem B i ol D r ug D e s，2011，78（6）：999-1005.

［8］ D e l ga do M，T e sf aig z iY.BH3-o n l y p rot ein s，B m f an d B im，in au to phagy［J］. C e ll C yc l e，2013，12（22）：3453-3454.

［9］ L ee E F，C z a bot a r P E，S mi t h B J，e t a l.C r y st a l str uc t u r e of AB T-737 c o mp l e x e d w i t h B c l-x L：imp l ica t i o n s for s e l ec t i v i t y of an t ag o ni sts of t he b c l-2 f ami l y［J］.C e ll D ea t h D i ff e r，2007，14（9）：1711-1713.

［10］A k iyama T，T ana k a S.B im：gua rd ian of t i ss ue h o me ost a s i s an d c r i t ica l r egu l a tor of t he immune s y st em，t um or igene s i s an d bo ne b i olo gy［J］. A r ch I mmun ol T he r E x p（W a rsz），2011，59（4）：277-287.

［11］L ucian o F，J ac q ue l A，C olos e tt i P，e t a l.P h os ph or y l a t i o n of B im-EL b y E rk1/2 o n s e r ine 69 p ro m ot e s i ts d eg r a d a t i o n v ia t he p rot ea so me pa t h w ay an d r egu l a t e s i ts p ro ap o p tot ic f unc t i o n［J］.O nc o gene，2003，22（43）：6785-6793.

［12］ W u D，Yu H，L i J.M echani s m s of r e s i st ance to EML4-ALK inhib i tors in n o n-s ma ll ce ll l ung cance r［J］.Z h o nggu o F ei A i Z a Z hi，2013，16（1）：48-53.

［13］S a s a k i T，K o i v unen J，O gin o A，e t a l.A n ov e l ALK s ec o n d a r ymu t a t i o n an d E G FR s igna l ing cau s e r e s i st ance to ALK k ina s e inhi b i tors［J］. C ance r R e s，2011，71（18）：6051-6060.

［14］ K a t ayama R，K han T M，B ene s C，e t a l.T he r apeu t ic str a t egie s to ov e r c o me c r i zot ini b r e s i st ance in n o n-s ma ll ce ll l ung cance rs ha rboring t he f u s i o n o nc o gene EML4-ALK［J］.Pro c N a tl A ca d S ci U S A，2011，108（18）：7535-7540.

［15］ So ng J Y，K im C S，L ee J H，e t a l.D ua l inhi b i t i o n of MEK1/2 an d E G FR s yne r gi st ica ll y in d uce s ca s pa s e-3-d epen d en t ap o p tos i s in E G FR inhi b i tor-r e s i st an t l ung cance r ce lls v ia BIM up r egu l a t i o n［J］. I n v e st N e w D r ug s，2013，31（6）：1458-1465.

［16］N g K P，H i ll me r AM，C huah C T，e t a l.A c o mm o n BIM d e l e t i o n p ol ym or phi s m me d ia t e s in tr in s ic r e s i st ance an d in f e r i or r e s p o n s e s to t yros ine k ina s e inhi b i tors in cance r［J］.N a t M e d，2012，18（4）：521-528.

［2014-10-24收稿］［2014-11-25修回］［编辑 阮萃才］

Role of BIM signaling in crizotinib-induced apoptosis in the EM L4-ALK-positive lung adenocarcinom a cell line H 2228

WEI Jiang1，2，PENG Haiyan1，2，SU Cuiyun1，SONG Xiangqun1，WANG Huilin1，NING Ruiling1，ZHOU Shaozhang1（1Department of Chemotherapy，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ZHOU Shaozhang.E-mail：179913337@qq.com

Objective To establish a crizotinib-resistant line of the EML4-ALK-positive lung adenocarcinoma cell line H2228 and compare it with the crizotinib-sensitive parental line to examine the possible role of BIM in crizotinib-induced apoptosis.M ethods H2228 human lung cellswere exposed to gradually increasing doses of crizotinib（50，100，200，500，1000 nmol/L）to create a crizotinibresistant line（H2228/CR）.Then H2228/CR and parental H2228 cellswere exposed to different doses of crizotinib，and their growth was compared using the MTT assay，while levels of apoptosiswere compared using flow cytometry.Western blottingwas used to compare levels of ALK，p-ALK，ERK，p-ERK and BIM in the two cell lines.Results After 8 months of crizotinib selection，the resistant lineH2228/CR showed an IC50of 3，418 nmol/L compared to 335 nmol/L for the parental H2228 line.The RI for H2228/CR cells was 10.20.Crizotinib inhibited the growth of H2228/CR cells to a much smaller extent than it inhibited H2228，and it led to a much smaller proportion of apoptotic cells in H2228/CR cultures.Levels of phospho-ERK were higher in H2228/CR cells，implying downregulation of BIM.Conclusion BIM may help mediate crizotinib-induced apoptosis in lung cancer，and its down-regulation may contribute to crizotinib resistance.

Lung neoplasm；EML4-ALK fusion gene；H2228 cell；Crizotinib；Acquired resistance；BIM

R734.2

A

1674-5671（2015）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.01.01

国家自然科学基金资助项目（81260357）

周韶璋。E-mail：179913337@qq.com