葡萄汁中抗肿瘤成分反式白藜芦醇含量的测定及其影响因素

赵光　李珺　陈超阳

【摘 要】 目的：利用高效液相色谱法（HPLC）测定葡萄汁中抗癌成分反式白藜芦醇的含量，并研究其环境影响因素。方法：选取ZORBAX-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：70%水-30%乙腈；波长：306nm；流速：1ml/min；进样量：20μl，葡萄汁经滤膜过滤后直接进样测定其中的反式白藜芦醇含量；并采用相同方法研究光照、温度及密封状况对其含量的影响。结果：淳果篮浓缩紫葡萄汁中反式白藜芦醇的含量为（1.64±0.07mg/l），汇源百分百的含量为（0.25±0.01mg/l），统一葡萄多中未检测到反式白藜芦醇。另外，阳光照射、升高温度、密封状况差都会导致反式白藜芦醇含量下降。结论：不同品牌的葡萄汁中反式白藜芦醇含量相差较大；低温避光密封条件下可减少葡萄汁中反式白藜芦醇的损失。

【关键词】 高效液相色谱法；葡萄汁；反式白藜芦醇

【中图分类号】R155.5+9 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）09-0019-03

Abstract：Objective To determine the content of trans-resveratrol，an anti-cancer active ingredient in grape juice，and to analyze the environmental influence factors of its content by high-performance liquid chromatography（HPLC）.Methods All samples were determined by ZORBAX-C18 column（250mm×4.6mm，5μm） at UV 306nm wavelength，using 70% water-30% acetonitrile as the mobile phase.The determination of grape juice was carried out by direct injection.After the determination，the same chromatographic conditions and methods were used to study the influence of light，temperature and sealed condition on the content of trans-resveratrol.Results The concentrations of trans-resveratrol in Huiyuan grape juice and Chunguolan purple grape juice were （1.64±0.07mg/L） and （0.25±0.01mg/L），respectively.No trans-resveratrol was found in Tongyi grape juice.The results show that，sunlight， high temperature and poor seal condition decreased the content of trans-resveratrol.Conclusion The content of trans-resveratrol varies in different brands of grape juice.The grape juice should be stored in cool，dark and sealed conditions to maintain the content of trans-resveratrol.

Keywords：HPLC；Grape juice；trans-Resveratrol

葡萄果實柔软、酸甜可口。随着生活水平提高，葡萄的消费需求提高，并且加工后的产品风味独特，如葡萄酒、葡萄果汁等相关食品增多[1]。如何监测并提高产品的品质，增强其保健功能逐渐受到关注。研究发现，葡萄含有丰富的多羟基酚类化合物——白藜芦醇，其在葡萄的果肉、果皮、种子、叶片、叶梗、穗轴等不同组织中均有分布[2]。葡萄饮品对人体有一定的保健效果，如：白藜芦醇成分对人体的代谢机能、细胞活性有调节作用[3-4]。

白藜芦醇（Resveratrol，简称Res）化学名称为3，4′，5-三羟基-1，2-二苯乙烯（ 3，4'，5-trihydroxystilbene），又称芪三酚，是芪类物质单体中最重要的活性物质。白藜芦醇为无色针状结晶，难溶于水，易溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂，熔点为256～258 ℃，升华温度为261 ℃[5]。遇碱性溶液氨水显红色，与三氯化铁-氰化钾发生显色反应可用来鉴定白藜芦醇。自然界中有顺、反两种结构，主要以反式构象存在，且反式异构体的生物活性强于顺式。白藜芦醇的生物活性多样，具有抗氧化[6]、抗自由基、抗肿瘤[7- 8]、抗炎、保护心血管、保护肝细胞[9]、抗肥胖[10]的功效。白藜芦醇的来源比较广泛，藜芦、虎杖、葡萄、花生、凤梨等天然植物中均含有白藜芦醇及其糖苷，白藜芦醇糖苷在肠道糖苷酶作用下可释放白藜芦醇，其中葡萄中白藜芦醇含量较高[11]。近年研究人员通过人工途径来合成白藜芦醇类似物[12]。

随着人们对白藜芦醇的保健功效和药效的关注，对白藜芦醇的研究也日渐增多，包括白藜芦醇类化合物的提取、结构和活性[13]。由于天然植物来源的抗肿瘤物质更安全[14]，含白藜芦醇的葡萄饮品倍受关注。目前，大多数研究集中在提取、分离、分析测定方法的改进上，包括三维荧光光谱法[15]、电喷雾多级质谱[16]、HPLC 法[17]。高效液相色谱法比较经典、可靠，用于检测白藜芦醇含量具有普适性，并且结合抗肿瘤等活性作用分析的较少，本文通过对白藜芦醇含量进行检测，分析其环境影响因素，作为产品保存和质量监测标准，具有良好的应用前景。在之前的工作中研究了葡萄酒中白藜芦醇的含量[18]，本文就葡萄果汁中白藜芦醇含量的HPLC检测方法及其环境因素的影响进行进一步的探讨。

1 材料及方法

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪；ZORBAX SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；50μl进样针（上海飞鸽公司）；0.45μm水系、有机系针式过滤器（天津津腾公司），Heidolph旋转蒸发仪；EYELA CCA-1111冷阱。

1.2 材料 反式白藜芦醇标准品（江苏南京泽朗生物科技有限公司），统一葡萄多，汇源百分百葡萄汁（标准号：Q/MAA D001S），淳果篮紫葡萄汁；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.3 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：70%水-30%乙腈；流速：1ml/min；进样量：20μl；柱温：室温；检测波长：306nm。

1.4 阳光照射对白藜芦醇含量的影响 将葡萄汁供试品分别分为A、B两份， A份密封避光保存，B份密封于自然光源下保存。保持其它因素相同，葡萄汁样品于0、2、4h后直接测定反式白藜芦醇含量。以A份样品为对照，研究光照对B份样品中反式白藜芦醇的含量是否有影响。

1.5 贮藏温度对白藜芦醇含量的影响 将葡萄汁分别平均分为A、B、C三组，模拟日常的贮藏条件，将其分别避光密封贮藏于4、20、40℃环境中。恒温6h后，分别测定各组中反式白藜芦醇的含量，研究贮藏温度对反式白藜芦醇的含量是否有影响。

1.6 密封状况对白藜芦醇含量的影响 将葡萄汁平均分为A、B两组，A组避光密封于阴凉处储存，B组避光开盖于阴凉处储存，保持其它条件相同，分别在24h、48h、72h后测定反式白藜芦醇的含量，研究密封状况对反式白藜芦醇的含量是否有影响。

1.7 样品测定 取三种市售葡萄汁（统一葡萄多、汇源百分百葡萄汁、淳果篮浓缩紫葡萄汁）分别进样20μl，重复测定3次，求峰面积的平均值，通过回归方程计算出反式白藜芦醇的质量浓度。

1.8 数据处理 用Origin Pro8软件绘制标准曲线并得到回归方程；用SPSS 19.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 定性分析 在选定的色谱条件下，测得反式白藜芦醇标准品的色谱图（见图1），标准品保留时间为8min；测得样品的色谱图（见图2）。

2.2 线性关系 精密称取反式白藜芦醇标样5.00mg，用乙腈溶解并定容至50ml，配成浓度为100.00 mg/L的标准溶液。取1ml该溶液定容至100ml，配制成浓度为1.00mg/L的溶液，后逐级稀释成浓度分别为5.00×10-1、2.50×10-1、1.25×10-1、6.25×10-2、3.12×10-2mg/L的标准溶液。每个浓度进样20μl，在上述色谱条件下分析，以峰面积Y对对应的质量浓度X（mg/L）进行线性回归，得线性方程为： Y=126.25175X+1.20303（R2=0.99903）。在0.0312～1.00mg/L线性关系良好。

2.3 精密度试验 在上述色谱条件下，精密吸取1.00mg/L对照品溶液20μl，重复进样6次，求得对应的反式白藜芦醇含量，得精密度RSD为1.90%，说明反式白藜芦醇较为稳定。

2.4 重复性试验 取同一批汇源百分百葡萄汁供试品溶液共5份，进样测定。求得对应的反式白藜芦醇含量，计算其含量的RSD值为1.16%，说明反式白藜芦醇在葡萄汁样品中较为稳定。

2.5 样品含量测定 测得统一葡萄多、汇源百分百果汁、淳果篮浓缩紫葡萄汁中反式白藜芦醇的峰面积与对应的反式白藜芦醇质量浓度见表1。

2.6 阳光照射对白藜芦醇含量的影响 A、B两组汇源百分百果汁供试品分别贮藏0、2、4h后峰面积与含量的变化情况见表2。

2.7 贮藏温度对白藜芦醇含量的影响 6h后A、B、C三组葡萄汁中反式白藜芦醇的峰面积及所对应的含量见表3。

2.8 密封状况对白藜芦醇含量的影响 A、B两组葡萄汁样品放置24、48、72h后的峰面积与对应的含量见表4。

3 讨论

在确定色谱条件时，考虑到的乙腈含量高的流动相使反式白藜芦醇的出峰时间过早，故加大水的比例至70%使其在8min左右出峰。葡萄汁的精密度試验和重复性试验所得RSD值均小于2.00%，符合要求，说明仪器的精密度及方法的重复性良好。

对葡萄汁样品进行反式白藜芦醇的含量测定，可知不同品牌的葡萄汁中反式白藜芦醇的含量有较大差异。统一葡萄多中未检出反式白藜芦醇，汇源百分百果汁中反式白藜芦醇的质量浓度较低，而淳果篮紫葡萄汁中反式白藜芦醇的质量浓度较高。

在光照对反式白藜芦醇含量的影响的研究中，贮存2、4h后，葡萄汁样品中反式白藜芦醇的含量显著降低。由于两组样品最初的反式白藜芦醇含量相同，除光照外其他贮藏条件亦相同，故可推断反式白藜芦醇含量的降低是光照所致。故葡萄饮品应注意避光保存。

在温度对反式白藜芦醇含量的影响的研究中，6h后葡萄汁样品中反式白藜芦醇的含量也呈递减趋势。由于样品中最初的反式白藜芦醇含量相等，且除贮藏温度外其他贮藏条件亦相同，故可推断其含量差异是由贮藏温度所导致，即反式白藜芦醇的含量随温度升高而下降。

在密封状况对反式白藜芦醇含量的影响的研究中，24h、48h、72h后不密封葡萄汁样品中反式白藜芦醇的含量也均降低。由于样品中最初的反式白藜芦醇含量相同，且除密封状况外其他贮藏条件均相同，故可推知密封状况对反式白藜芦醇的含量有影响，密封条件差可导致反式白藜芦醇含量下降。

实验证明不同品牌的葡萄汁中反式白藜芦醇含量相差较大，阳光照射、升高温度及密封状况差都会引起葡萄饮品中反式白藜芦醇含量的下降，低温、避光且密封的条件下可减少葡萄汁中反式白藜芦醇的损失。

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（收稿日期：2015.02.04）