载脂蛋白E基因多态性与遗忘型认知功能障碍的相关性研究

何重远 刘百薇 柏琪 陶霖 佡剑非 郑东明

载脂蛋白E基因多态性与遗忘型认知功能障碍的相关性研究

何重远 刘百薇 柏琪 陶霖 佡剑非 郑东明

目的 探讨载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因多态性与遗忘型轻度认知功能障碍(amnestic mild cognitive impairment,aMCI)的相关性。 方法 应用聚合酶链反应产物直接测序法检测并分析比较63例aMCI患者和60例年龄匹配的认知功能正常老年人的ApoE基因多态性。 结果 aMCI组ApoE基因型中ε3/4型的频率(28.6%)显著高于正常老年组(13.3%),其他基因型频率2组间无明显差异。aMCI组ApoEε4的等位基因频率(25%)显著高于正常老年组(11.5%),ε2和ε3的等位基因频率尚无显著性差异。 结论 aMCI患者有较高的ApoE ε4基因携带率,对这一指标进行检测,可以对该类患者进行全面客观的评价。

载脂蛋白E; 轻度认知功能障碍; 基因多态性

轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment,MCI)是介于正常老化和痴呆之间的中间状态,其中以记忆力障碍为主要表现的遗忘型认知功能障碍(amnestic MCI,aMCI)被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的前驱状态,以每年10%～16.5%的比例进展为AD。已经有大量的研究表明载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)等位基因ε4是与散发AD最为相关的风险基因[1]。本研究对aMCI患者的ApoE基因多态性进行检测及分析, 并与健康老年人群进行对照, 以探讨ApoE基因与aMCI的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 在本院体检中心、神经内科记忆力障碍门诊招募符合研究条件的老年志愿者。aMCI组入组标准:(1)有记忆力减退的主诉;(2)临床痴呆评定量表(clinical dementia rating,CDR)评分为0.5分,蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分<26分,听觉词语学习测验的延迟回忆低于正常参考值1.5个标准差以上;(3)简易精神状况检查量表(MMSE)、日常生活能力量表(ADL)、焦虑抑郁自评量表评分在正常范围;(4)没有明确的心脑血管、神经、精神类疾病病史,无酗酒及药物滥用史,常规体检化验排除高血压、糖尿病、甲状腺功能异常、维生素B12缺乏;(5)磁共振常规序列扫描没有明显的脑白质疏松、脑梗死等影像学改变;(6)子女和本人同意参与该项研究并签署知情同意书。最终共纳入研究aMCI组63例,男27例,女36例,年龄60～77岁,平均(69.0±5.1)岁,教育程度(10.5±3.2)年。

对照组入组标准:(1)CDR评分0分;(2)MMSE、ADL、焦虑抑郁自评量表、MoCA评分在正常范围;(3)满足aMCI入组标准第4～6项之要求。对照组60例,男26例,女34例,年龄60～77岁,平均(69.4±4.6)岁,教育程度(11.1±3.4)年。

2组间年龄、性别、教育程度无统计学差异(P>0.05)。本研究得到中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会的批准。

1.2 ApoE基因多态性检测 抽取肘静脉血2 ml,置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管内,分离白细胞用于检测ApoE基因型。DNA的抽提采用酚/氯仿法, 适量双蒸水溶解后作为PCR模板。

利用primer 5.0软件设计ApoE特异性扩张引物,上游引物(ApoE-F)为5′-GCCCCGTTCCTTCTCTCCCTCTT-3′,下游引物(ApoE-R)为5′-CCGGCTGCCCATCTCCTCCATC-3′, 扩增产物大小为647 bp,交由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。PCR反应体系包括:2×Pcr Mix 12.5 μl(Promega),上下游引物各1 μl(10 μMmol/L),DNA模板1 μl(30～60 ng/μl),加双蒸水至总体积25 μl。PCR反应条件为95 ℃预变性2 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共30个循环;72 ℃后延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确定特异性扩增产物。测序分析使用PCR产物测序法,利用ABI 3730XL测序仪(美国ABI公司),ApoE-F为测序引物进行测序,采用Chromas软件分析实验结果。

ApoE基因有ε2、ε3和ε4 3种等位基因,相应的ApoE基因型有3种纯合型(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)和3种杂合型(ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4)。依据位于112位和158位的2个氨基酸残基种类来确定对应的等位基因:ε2(112Cys/158Cys)、ε3(112Cys/158Arg)、ε4(112Arg/158Arg)。

1.3 基因型和等位基因频率计算方法 基因型频率=基因型频数/总例数; 等位基因频率采用平衡法:ε2=ε2/2+1/2 (ε2/3+ε2/4); ε3=ε3/3+1/2 (ε2/3+ε3/4); ε4=ε4/4+1/2 (ε3/4+ε2/4)

1.4 统计学分析 计量资料比较采用独立样本t检验,计数资料比较采用χ2检验,全部结果均采用SPSS 10.0软件处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ApoE基因型频率 2组ApoE基因型分布都以ε3/3型多见,在健康对照组为65%,在aMCI组为50.8%,2组间比较无统计学差异。aMCI组ε3/4的基因型频率(28.6%)显著高于对照组(13.3%)(P=0.04),ε4/4、ε3/2、ε2/4的基因型频率2组间均无统计学差异,详见表1。2组均未检测到ε2/2基因型。

表1 2组ApoE基因型频率(n,%)

注:与对照组比较,*P<0.05

2.2 ApoE等位基因频率 aMCI组ε4等位基因频率为25%,显著高于对照组的11.5%(P<0.05),ε2、ε3的等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 2组ApoE等位基因频率(%)

注:与对照组比较,*P<0.05

3 讨论

Strittmatter等[2]于1993年首先报道了ApoE ε4等位基因是AD的高危因素和易患基因,携带一个ε4等位基因可以使其患迟发AD的发病风险增加2～3倍,携带2个ε4等位基因可以使其患迟发AD的发病风险增加>8倍。此后,国外大量的流行病学研究不断证实ApoE ε4基因型是AD发病的易感基因和独立危险因素,这一结论已经得到多个痴呆诊疗指南的确认[1, 3]。国内针对这一问题的大样本流行病学研究虽然不多,但一项基于国内1990～2010年各研究数据的Meta分析也显示等位基因ApoE ε4是中国人群AD的危险基因(OR=3.53,95%CI:2.49～5.00)[4]。

由于aMCI与AD关系密切,近年来国外已经有些研究着眼于aMCI患者的ApoE的基因型分布特点,但是结论不一。许多研究提示ApoE ε4等位基因与aMCI密切相关[5-6],但也有部分研究并未发现两者的相关性,如Heun等[7]基于社区人群的观察并未发现ApoE ε4基因与aMCI的发病相关。国内针对这一问题的研究很少,所采用的aMCI的评价标准也过于简单[8],影响结论的可信度。我们的研究显示aMCI患者的ε3/4基因型频率显著高于正常对照组,ε4等位基因频率显著高于正常对照组,与大多数国外研究结论相似[5-6]。一些研究发现，ε2和ε3等位基因可能是AD和MCI的保护性因素[2，4],我们的研究并未发现ε2、ε3等位基因频率在2组间有明显的差异,这一问题还需要进一步扩大样本进行观察。

目前已经有大量研究试图从分子生物学水平阐述ApoE基因多态性影响AD的病理生理过程。目前研究结果显示AD的主要病理变化,如神经炎性斑、神经原纤维缠结、脑淀粉样血管病变均受到ApoE基因多态性的影响,其中ApoE ε4往往与上述病理改变更加严重有关。与其他表型相比,ApoE ε4可导致脑内Aβ清除率下降和Aβ沉积增加、微管蛋白稳定性下降、突触功能障碍、更重的炎性反应和更差的神经修复能力[9-10]。这方面的研究虽然很多,但还没能从根本上阐明ApoE基因在中枢神经系统的生理和病理生理过程中发挥怎样的作用,值得进一步深入研究。

本研究采用的是PCR产物直接测序法,该技术成熟稳定,测试价格也比以前大幅下降,适合临床开展。需要强调的是ApoE ε4基因型仅仅是AD的危险因素之一,而并非是AD发病的决定性因素,因此ApoE基因多态性检测并不能用于AD和aMCI的临床诊断, 更不能代替临床、神经心理及神经影像等检查。但是,目前针对AD和MCI患者进行ApoE基因多态性检测还是有一定的临床实际意义,主要表现为以下方面:首先由于对aMCI患者是否需要给予抗痴呆药物治疗尚有争议[11],而一些研究提示携带ApoE ε4基因的aMCI患者更容易进展为AD[12-13],因此在治疗指南更改之前,可以对携带ApoE ε4基因的aMCI患者进行比较积极的抗痴呆药物干预;其次,尽管仍有争议,一些研究提示携带ApoE ε4基因的aMCI、AD患者对胆碱酯酶抑制剂的反应要优于非携带者[14-16],所以对携带者的治疗可以以胆碱酯酶抑制剂为主,而对非携带者如果胆碱酯酶抑制剂疗效不佳的话可尽早考虑更换或者合并使用其他种类药物如盐酸美金刚。此外,ApoE ε4与AD和aMCI的密切关系也为AD治疗提供了新思路,如可以抑制ApoE ε4基因表达的他汀类药物是否能对AD有治疗作用一直是近几年研究的热点[17]。

综上所述,本研究显示aMCI患者有着较高的ApoE ε4基因携带率,与国外流调结论类似。临床上可以开展针对认知功能障碍患者的ApoE基因多态性检测,在结合临床、神经心理及神经影像等其他检查基础上, 可以为AD和aMCI诊断及干预方案提供更多的临床决策依据。

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Association between genetic polymorphisms of apolipoprotein E and amnestic mild cognitive impairment

HEZhong-yuan.ClinicalLaboratory;LIUBai-wei,BAIQi,TAOLin,NAOJian-fei,ZHENGDong-ming.

DepartmentofNeurology,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China

Objective To investigate the relationship between genetic polymorphisms of apolipoprotein E (ApoE) and amnestic mild cognitive impairment (aMCI). Methods Direct PCR sequencing was used to analyze the genetic polymorphisms of ApoE in 63 patients with aMCI and 60 age-matched old people with normal cognitve functions. Results The frequency of ApoE ε3/4 genotype was 28.6% in the aMCI group, which was significantly higer than that in the control group (13.3%). There were no differences in the frequencies of other genotypes of ApoE between the two groups. The frequency of allele ε4 in the aMCI group (25%) was significantly higher than that in the control group (11.5%). No difference in the frequency of allele ε2 and ε3 was found between the two groups. Conclusions Higher allele frequency of ApoE ε4 is associated with aMCI. The detection of polymorphism of ApoE might be beneficial for a thorough evaluation of aMCI.

apolipoprotein E; mild cognitive impairment; gene polymorphism

国家自然科学基金资助项目(81000467)

110004辽宁省沈阳市，中国医科大学附属盛京医院医学检验中心(何重远)；中国医科大学附属盛京医院神经内科(刘百薇，柏琪，陶霖，佡剑非,郑东明)

郑东明，Email: zhengdm@sj-hospital.org

R 749.16

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.02.007

2014-04-25)