醌氧化还原酶2下调对大鼠主动脉平滑肌细胞线粒体膜电位的影响

蔡静波 季鹏 尹红丽 王岚 郭红梅

醌氧化还原酶2下调对大鼠主动脉平滑肌细胞线粒体膜电位的影响

蔡静波 季鹏 尹红丽 王岚 郭红梅

目的 研究醌氧化还原酶2(NQO2)下调对大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs)线粒体膜电位的影响。 方法 将RASMCs分为3组:野生型组、阴性对照组和NQO2下调组。利用RNA干扰技术下调体外培养的RASMCs中 NQO2, 采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)渗入法检测细胞增殖,用阳离子染料JC-1标记RASMCs线粒体内膜并检测线粒体膜电位,试剂盒法检测总超氧化物歧化酶(SOD)活性和细胞色素C水平。 结果 在野生型组、阴性对照组和NQO2下调组中,BrdU阳性细胞比率分别为(18.94±1.43)%,(18.29±0.92)%和(9.21±1.42)%,NQO2下调组的细胞增殖明显被抑制(P<0.01); 3组细胞经JC-1标记后红色/绿色荧光比值分别为15.48±0.41,15.96±0.52和13.58±0.12,NQO2下调组细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.01)。细胞色素C水平在3组细胞中分别为(9.62±0.29) ng/L,(9.36±0.07) ng/L和(15.83±0.83) ng/L,NQO2下调组明显升高(P<0.01)。 结论 NQO2的下调可降低RASMCs线粒体膜电位,致细胞色素C释放增加,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,发挥抗动脉粥样硬化作用。

线粒体膜电位; 大鼠主动脉平滑肌细胞; 醌氧化还原酶2; RNA干扰; 凋亡

动脉粥样硬化是公认的心脑血管疾病的病理生理基础,而后者仍然是目前我国国民主要的致死、致残原因,造成极大的社会经济损失[1]。现有研究证实线粒体功能异常可引起内皮功能障碍、血管平滑肌细胞增殖、巨噬细胞凋亡,从而导致动脉粥样硬化的发生、发展及粥样斑块的破裂,诱发临床事件[2]。

我们的前期研究发现采用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术下调大鼠主动脉平滑肌细胞(RVSMCs)中的一种黄素蛋白——醌氧化还原酶2(quinone reductase 2, NQO2)的表达,可降低细胞内氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的水平,阻抑细胞因子ERK1/2的磷酸化,从而抑制细胞的增殖[3],但这一过程是否有线粒体的参与尚不十分清楚。本研究通过探讨下调NQO2基因对RVSMCs线粒体膜电位及其氧化还原功能的影响,从而为在亚细胞水平上防治动脉粥样硬化性疾病提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 RASMCs购自齐氏生物科技公司;DMEM培养基、胎牛血清、D-Hank’s液、胰蛋白酶消化液购自Gibco公司;50 ml细胞培养瓶、6孔细胞培养板为corning公司产品;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)检测试剂盒、ATP检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、细胞色素C检测试剂盒及JC-1线粒体膜电位检测试剂盒均购自南京凯基生物科技公司;倒置荧光显微镜为Nikon公司产品。

1.2 大鼠主动脉RASMCs的培养与鉴定 RASMCs原代细胞贴壁生长于含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中,置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养,每4 d换液1次。待细胞长至80%～90%融合时用0.125%胰蛋白酶消化液传代培养,第3～8代细胞用于实验。RASMCs呈梭形,具有“峰-谷样”的生长方式。

1.3 RNA干扰慢病毒载体感染RASMCs及实验分组 根据前期研究向上海吉凯基因化学技术有限公司定制针对大鼠NQO2 mRNA的RNA干扰慢病毒载体(Psc-NQO2)及阴性对照载体(Psc-NC)[4]。RASMCs以1×105个/孔的密度接种于六孔板中,24 h后每孔加入病毒液(滴度为5×108TU/ml)10 μl,孵育12～24 h后荧光显微镜下观察到绿色荧光的表达时,更换新鲜培养液培养72 h进行后续实验。实验分为3组,野生型即正常的RASMCs,阴性对照组即感染Psc-NC的RASMCs,NQO2下调组即感染Psc-NQO2的RASMCs。

1.4 Western blotting检测NQO2 各组细胞加预冷的细胞裂解液200 μl冰浴30 min,4 ℃、13 000 g离心10 min,取上清测定蛋白质浓度。样品经蛋白质电泳后转至PVDF膜。一抗为兔抗鼠NQO2(1∶400)和兔抗鼠β-actin(1∶1000),二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG,采用化学发光法检测。

1.5 JC-1法检测线粒体膜电位 JC-1是一种具有线粒体膜电位依赖性聚集特性的阳离子染料。线粒体膜电位未降低或降低时,JC-1分别发射红色和绿色检测光,因此可用红色/绿色荧光比值表示线粒体膜电位的降低。弃去旧培养液,用无血清培养基稀释的JC-1溶液(终浓度为10 mg/L)对细胞进行染色,37 ℃孵育30 min后弃去染料,用GENios Pro reader (Tecan公司,瑞士)进行检测,以红色/绿色荧光比值表示线粒体膜电位的下降情况。

1.6 BrdU检测细胞凋亡 BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物,可在细胞增殖过程中参与核酸的合成,因此检测BrdU的分布可判断细胞增殖的情况。干预后的细胞在终止培养前用BrdU(终浓度为30 μg/L)于37 ℃孵育40 min,PBS洗涤细胞3次,甲醇/醋酸固定10 min,依次加兔抗大鼠BrdU单抗(工作浓度1∶50)和羊抗兔IgG(1∶200),用ABC法检测,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数。

1.7 SOD活性及细胞色素C检测 均按照试剂盒说明书操作,采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活力,采用双抗体夹心 ABC-ELISA法测定细胞色素C水平。

2 结果

2.1 RNA干扰降低RASMCs中NQO2水平 经western blotting检测,感染Psc-NQO2 72 h后的RASMCs胞浆内NQO2含量较野生型RASMCs降低约77.8%(0.222∶1),而阴性对照组与野生型组比较,细胞内NQO2水平无明显改变(0.923∶1)。见图1。

注:1为野生型组,2为阴性对照组,3为NQO2下调组图1 Western blotting检测RASMCs中NQO2水平

2.2 NQO2下调对RASMCs增殖的影响 野生型和阴性对照组RASMCs中BrdU阳性细胞比率分别为(18.94±1.43)%和(18.29±0.92)%,而NQO2下调组RASMCs中BrdU阳性细胞比率为(9.21±1.42)%,明显低于前2组(P<0.01)。所以,NQO2下调可明显抑制RASMCs增殖。见图2。

图2 NQO2下调对RASMCs增殖的影响(×100)

2.3 NQO2下调对RASMCs线粒体膜电位的影响 NQO2下调组的红色/绿色荧光比值为13.58±0.12,明显低于野生型的15.48±0.41和阴性对照组的15.96±0.52(P<0.01)。结果显示NQO2下调可使RASMCs线粒体膜电位下降。

2.4 NQO2下调对RASMCs总SOD活性及细胞色素C的影响 NQO2下调组的总SOD活性较野生型和阴性对照组升高,但差异无统计学意义(P分别为0.224和0.261)。而NQO2下调组的细胞色素C水平则明显高于野生型组和阴性对照组(P<0.01)。见表1。

组别总SOD活性(U/ml)细胞色素C(ng/L)野生型组928.30±53.259.62±0.29阴性对照组933.10±50.429.36±0.07NQO2下调组984.67±49.1215.83±0.83**

注:与野生型组和阴性对照组比较,**P<0.01

3 讨论

动脉粥样硬化目前被公认为是一种由多因素导致的炎症反应性疾病[5]。殷亚昕等[6]报道辛伐他汀能通过降低动脉粥样硬化大鼠高迁移率族蛋白1及其基因的表达,减轻炎症反应,从而减少动脉粥样硬化斑块的形成。以往研究发现一种具有心血管保护作用的多酚类化合物白藜芦醇可抑制血管平滑肌细胞的增殖，诱导其凋亡,从而实现抗动脉粥样硬化的作用[7]，且这种多酚类化合物可与NQO2形成晶体结构从而降低胞浆内的NQO2水平。而利用RNA干扰技术构建的NQO2沉默的K562细胞同白藜芦醇干预的K562细胞具有类似的抗甲萘醌毒性的特性[8-9],所以有学者认为白藜芦醇是通过抑制NQO2实现心血管保护作用的,但其具体的细胞内作用途径和机制尚不十分清楚。

近年来的研究显示线粒体在动脉粥样硬化进程中发挥重要作用。线粒体通过释放过量的ROS导致其自身的功能障碍,从而诱导血管炎症的发生,动脉粥样硬化的发展[10]。线粒体在细胞凋亡过程中也发挥了关键作用,包括caspase激活物的释放、电子转移功能的丧失、线粒体跨膜电位的降低甚至消失,以及Bcl-2等蛋白的功能变化[11]。线粒体跨膜电位的下降是细胞凋亡级联反应过程中较早发生的事件。因此,线粒体跨膜电位是常用的早期检测细胞凋亡的指标之一。

本研究采用以往使用的RNA干扰慢病毒载体感染RASMCs的技术实现下调NQO2基因及蛋白的表达。结果显示与野生型及阴性对照组相比,NQO2下调组RASMCs的增殖受到明显抑制,线粒体膜电位显著下降,同时伴有细胞色素C水平的明显升高,提示NQO2基因的下调可影响线粒体的正常功能,诱导细胞凋亡的发生。

细胞内氧化应激也与细胞凋亡有着密切的关系。线粒体DNA突变可致线粒体呼吸衰竭而造成ROS的生成增加,ROS可进一步诱导线粒体DNA的突变,引起呼吸衰竭和脂质过氧化的形成,如此循环导致细胞损伤[12]。本研究发现NQO2基因下调组的总SOD活性较野生型和阴性对照组有升高,但无统计学差异,提示NQO2基因水平与RASMCs的氧化应激状态有一定关系。

综上所述,NQO2的下调可降低RASMCs线粒体膜电位,致细胞色素C释放增加,从而诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。因此,白藜芦醇抗动脉粥样硬化的作用机制与下调血管平滑肌细胞的NQO2表达、影响线粒体功能、诱导细胞凋亡有关。

[1] 中国高血压防治指南修订委员会. 中国高血压防治指南2010 [J]. 中华心血管病杂志, 2011,39(7): 579-615.

[2] Puddu P, Puddu GM, Cravero E, et al. The emerging role of cardiovascular risk factor-induced mitochondrial dysfunction in atherogenesis[J]. J Biomed Sci, 2009, 16: 112-120.

[3] Zhang XW, Wang Y,Cai JB, et al. Downregulation of quinone reductase 2 attenuates vascular smooth muscle cells proliferation and neointimal formation in balloon injured rat carotid artery [J]. Cell Physiol Biochem，2012，29(3/4): 453-462.

[4] Cai JB,Zhang ZH,Xu DJ, et al. Negative regulation of quinone reductase 2 by resveratrol in cultured vascular smooth muscle cells [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2008, 35(12): 1419-1425.

[5] Jawien J. Atherosclerosis in 2012: what is new?[J].Pol Arch Med Wewn, 2012,122(4): 170-173.

[6] 殷亚昕, 刘润梅, 翟红霞,等. 辛伐他汀对动脉粥样硬化大鼠高迁移率族蛋白1表达的影响[J]. 实用老年医学,2010,24 (2): 128-131.

[7] Poussier B, Cordova AC, Becquemin JP, et al. Resveratrol inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and induces apoptosis [J]. J Vasc Surg, 2005,42(6): 1190-1197.

[8] Wang Z, Hsieh TC, Zhang Z, et al. Identification and purification of resveratrol targeting proteins using immobilized resveratrol affinity chromatography [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,323(3): 743-749.

[9] Buryanovskyy L, Fu Y, Boyd M, et al. Crystal structure of quinone reductase 2 in complex with resveratrol[J]. Biochemistry, 2004,43(36): 11417-11426.

[10]Madamanchi NR, Runge MS. Mitochondrial dysfunction in atherosclerosis [J]. Circ Res, 2007,100(4): 460-473.

[11]Halestrap AP. What is the mitochondrial permeability transition pore? [J].J Mol Cell Cardiol, 2009,46(6): 821-831.

[12]黄清松,李红枝,陈爱葵. 姬松茸多糖对大鼠胸腺细胞凋亡和线粒体膜电位的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2013,19(10): 232-235.

Effects of down-regulation of quinone reductase 2 on mitochondrial membrane potential in rat aortic smooth muscle cells

CAIJing-bo,JIPeng,YINHong-li,WANGLan,GUOHong-mei.

DepartmentofCardiology,JiangsuProvinceGeriatricInstiture,Nanjing210024,China

Objective To investigate the effects of down-regulation of quinone reductase 2 (NQO2) on mitochondrial membrane potential in rat aortic smooth muscle cells (RASMCs). Methods RASMCs were divided into three groups, wild group, negative control group and NQO2down-regulated group. A lentiviral vector incorporating NQO2 short interference RNA of short hairpin was transduced into RASMCs. Cell proliferation was detected by bromodeoxyuridine (BrdU) assay. Flow cytometry was used to observe mitochondrial membrane potential. The contents of superoxide dismuta (SOD) and cytochrome C were detected by using kits. Results The proliferation of RASMCs was significantly inhibited by down-regulation of NQO2. Mitochondrial membrane potential in RASMCs with lower NQO2(13.58±0.12) was obviously lower than that in wild (15.48±0.41) and negative control cells (15.96±0.52) (P<0.01). Compared with wild (9.62±0.29 ng/L) and negative control cells (9.36±0.07 ng/L), RASMCs with suppressed NQO2 had significantly higher level of cytochrome C(15.83±0.83 ng/L) (P<0.01). Conclusions This study suggests that down-regulation of NQO2 signi-ficantly suppresses RASMCs proliferation and mitochondrial membrane potential, which may be the mechanism against atherosclerosis.

mitochondrial membrane potential; rat aortic smooth muscle cells; quinone reductase 2; RNA interference; apoptosis

江苏省自然科学基金(BK2011841)

210024江苏省南京市，江苏省老年医学研究所心内科

R 543.5

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.02.008

2014-05-05)