多发性硬化症显像剂11C-CIC的合成

张锦明，张晓军，黄德晖，王 卉，刘 健，田嘉禾

（1.解放军总医院 核 医学科，北京 100853；2.解放军总医院 神 经内科，北京 100853）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种慢性、炎症性、脱髓鞘的中枢神经（CNS）疾病，病理改变为大脑和脊髓的神经髓鞘斑块性的破坏，由于PET缺少特异性显像剂，目前影像学诊断MS以MRI为主。与MRI相比，PET／CT诊断MS灵敏性更高，18F-FDG结果表明，与正常人相比，MS病人整脑的FDG摄取降低了3%～18%，摄取降低的主要区域为皮层和白质［1］。但在稳定的 MS病人中，由于大面积的髓鞘斑块，FDG摄取反而增高，增加了MS鉴别诊断的难度。Stankoff等［2］发现用于早老痴呆（AD）诊断的刚果红可与CNS的髓磷脂结合，因此用诊断AD的11C-PIB用于诊断MS，经二例患者的动态PET显像表明，可以定量分析脱髓鞘情况。最新研究表明［3］，11C-PIB在髓磷脂密度很高的区域的放射性分布很低，不适用于研究MS。因此，MS显像剂的特异性是关键问题。2006年，Wu CY等［4］研制第一个靶向髓磷脂 （myelin）的PET显像剂4－（4-（4-氨 基 苯 乙 烯基）-2，5-二 甲 氧 基苯乙烯基）-［N-甲基－11碳］苯胺（11C-CIC），体外研究表明CIC与CNS的髓磷脂结合，而与髓鞘斑块不结合。经MS动物模型证实，11C-CIC能特异性反映髓鞘病变的范围和程度，甚至在功能代偿期而病理尚未出现明显变化时就已发现摄取异常。随后比较了11C-CIC与其他MS显像剂的区别，认为11C-CIC在诊断MS方面有一定的价值［5－6］。Wang YM 采用碘代甲烷与 CIC前体反应，在弱碱条件下甲基化，但甲基化效率不高［7］。本研究尝试用活性更高的Triflate-CH3作甲基化试剂，自动化合成了11C-CIC，提高合成效率，同时研究其体外稳定性，并进行Micro PET／CT显像研究。

1 实验材料

HM-20回旋加速器：日本住友重机械株式会社；PET自动化碳-11多功能合成模块：内置液相碘代甲烷、Triflate在线转换、甲基化和HPLC纯化（配紫外和放射性检测器）及固相萃取等设备：派特（北京）科技公司；分析HPLC仪，配Biocan Flow Count放射性检测器和2487紫外检测器，C-18柱：美国 Waters公司；1 mol／L的氢化锂铝四氢呋喃溶液：德国，ABX公司；57%HI：AR，美国Acros公司；100 g／L的Vc溶液：美国 Mc Guff公司；乙醇（USP级，美国Milenniu m公司；丙酮：AR，美国Sigma公司；前体：4-（4-（4-氨基苯乙烯基）-2，5-二甲氧基苯乙烯基）-苯胺和标准品4-（4-（4-氨基苯乙烯基）-2，5-二甲氧基苯乙烯基）-［N-甲基］苯胺：美国Case大学Wang YM教授赠送；e XPlore Vista小动物PET／CT成像系统：美国GE公司。

2 实验方法

2.1 在线转换11 C-CH3－Triflate

采用 H M-20加速器经14N（p，α）11C反应，在靶内生成11CO2。将11CO2传到浸于液氮中的LOOP环（0.3 mm×5 000 mm）上，11CO2经LOOP时被固化成干冰滞留在LOOP环内。自动化碳-11多功能合成模块合成11C-碘代甲烷，LOOP环脱离液氮后经空气加热，干冰重新转化成气态的11CO2，由40 mL／min的氮气将11CO2输送到含0.2 mL 1 mol／L的氢化锂铝四氢呋喃（T HF）溶液的反应管中，11CO2与氢化锂铝反应生成复合盐，复合盐与氢碘酸反应生成碳-11碘代甲烷。由氮气将碳-11碘代甲烷载带入已加热到200℃不锈钢管（10 mm×70 mm），管内有0.4 g三氟甲基磺酰基银与0.65 g石墨混合物，碳-11碘代甲烷在线转换成11C-CH3－Triflate［8］，进入下一反应瓶。

2.2 11 C-CIC的合成

将11C-CH3－Triflate通入到新配制含1～2 mg的去甲基CIC前体的200μL丙酮溶液内，反应瓶冷却到6℃左右，观察R4的放射性计数，待R4的放射性计数达到最大，停止通入11C-CH3－Triflate。反应瓶在室温或加热到90℃，维持3 min。将V14瓶内HPLC流动相液体加到反应瓶终止反应，并液体转移到半制备 HPLC柱（Alltech C-18 10 mm×150 mm）上纯化（图1中D部分）；流动相为V（乙腈）∶V（水）＝8∶2的溶液，流速为5 mL／min，收集7～8 min的放射性液体，将收集的放射性液体与60 mL注射用水混合，混合液过Sep-Pak C-18柱（Sep-Pak C-18柱预先用10 mL乙醇活化，再用10 mL水清洗），11C-CIC吸附在Sep-Pak C-18柱上，将24号瓶内10 mL水清洗该柱后，用22号瓶内1 mL乙醇将产品从柱上洗脱，并用25号瓶内9 mL生理盐水稀释，过无菌膜即可。

2.3 放化纯度

HPLC方法测量条件为：Waters的HPLC，2487紫外分光光度计，检测波长254 nm；515泵，分析柱为反相Phenomens C-18柱（3.9 mm×150 mm），Bio-Scan的Flow-Count放射性检测器。流动相为V（乙腈）∶V（水）＝7∶3的混合溶液，流速为1 mL／min，未反应的11C-CH3－Triflate的tR＝2.6 min，11C-CIC的tR＝7.1 min，副产品的tR＝4.4 min。

图1 11 C-CIC的化学合成模块Fig.1 The chemical module of radio-synthesis for 11 C-CIC

图2 合成11 C-CIC线路图Fig.2 Scheme of 11 C-CIC synthesis

2.4 11 C-CIC体外稳定性

将最后形成的含10%乙醇、浓度为300 TBq／L的11C-CIC室温放置，每间隔10 min用 HPLC测量11C-CIC的放化纯度。从SEP-PAK C-18柱上淋洗下来的11C-CIC乙醇溶液，用100 g／L的Vc和生理盐水溶液稀释，最终得含10%乙醇及10 g／L Vc、浓度为300 TBq／L的11C-CIC，相同方法测放化纯度。

2.5 11 C-CIC在正常小鼠体内的生物分布

取20±2 g的NH雄性小鼠（中国人民解放军总医院动物中心提供）20只，编号后计算机随机分成4组，尾静脉注射11C-CIC 的3.7 MBq／0.1 mL，于注射后5、15、30、60 min分别处死小鼠，取血、心、肝、脑等主要器官，称重并在井型计数器上计数，计算各器官的放射性摄取率（ID%／g）。

2.6 Micro PET／CT显像

NH小鼠和SD正常大鼠（军事医学科学院动物中心提供）2只。腹腔注射5%的水合氯醛麻醉，注射后30 min置于e Xpl ore Vista Micr o PET／CT上扫描，NH小鼠行全身扫描，大鼠仅做头部扫描。先行PET再行CT以定位，确定放射性浓集的部位。

3 结果与讨论

3.1 11 C-CIC的合成

从4-（4-（4-氨基苯乙烯基）-2，5-二甲氧基苯乙烯基）-苯胺的化学结构分析，其分子式上有二个对称的苯胺；苯胺很容易发生甲基化反应，如11C-PIB的合成，在室温下甲基化效率高达65%。Ono M等［9］采用的顺式二苯乙烯胺也可以在室温下与11C-Triflate-CH3反应。但本研究中CIC前体在丙酮或DMSO等溶剂中，在常温下不发生甲基化反应，加热后才能发生反应，可能是受两个共轭健影响。

图3a为经半制备HPLC纯化11C-CIC的放射性色谱图分析，流动相为60%的乙腈，在4.0 min到15 min处一个较大的放射性峰，该峰不是11C-Triflate-CH3，而是其他杂质。收集16 min处的放射性液体，HPLC分析发现产品的放化纯度很低，出现了多个杂质峰（图3b），说明60%的乙腈作半制备的流动相不合适。分别采用60%、70%和80%的乙腈作流动相，发现升高乙腈的浓度，缩短了产品在HPLC柱上的保留时间，杂质峰随浓度升高而降低。采用80%乙腈作HPLC流动相分离，最终产品的放化纯度仍低于95%。

3.2 11 C-CIC体外稳定性

采用不同浓度的乙腈作流动相，发现提高流动相中乙腈的浓度，产品在HPLC柱上的保留时间缩短，杂质峰面积随乙腈浓度升高而降低，分析收集到产品的放化纯度，产品的放化纯度随流动相中乙腈的上升而提高，说明可能产品在Semi-HPLC分离过程中分解。最终产品经SEP-PAK C-18柱固相萃取，加入10%的乙醇，室温放置；产品在常温下分解很快，说明11C-CIC体外不稳定。文献在合成18F-W372中加入抗坏血酸以提高体外稳定性［10］，在分离11C-CIC的HPLC流动相中加入10 g／L的抗坏血酸，发现杂质峰面积下降（图4a），同时收集半成品的放化纯度大于99%（图4b），与图3b相比，在3～5 min的杂质峰消失，说明10 g／L的抗坏血酸防止了11C-CIC的分解。在最终产品中加入10 g／L抗坏血酸，室温放置，观察60 min，产品11C-CIC的放化纯度仍大于99%，体外稳定性良好。

图3 11 C-CIC的HPLC放射性色谱图a——purification of Semi-HPLC（60%acetonitrile as mobile）；b——analysis HPLC（60%acetonitrile as mobile）Fig.3 Radio-chromatogram of 11 C-CIC

图4 11 C-CIC的HPLC放射性色谱图a——purification of Semi-HPLC（80%acetonitrile and 10 g／L Vc as mobile）；b——sanalysis HPLC（70%acetonitrile as mobile）Fig.4 Radio-chromatogram of 11 C-CIC

3.3 11 C-CIC的质量控制

分析HPLC放射性色谱图表明（图4b），11C-CIC的放化纯度大于99%，几乎无放射性杂质；紫外未见有前体存在。共进CIC标准品的UV保留时间表明，放射性峰与标准品在HPLC上有相同的保留时间，证实放射性物质为CIC。由于CIC中共轭的作用，产品呈淡绿色，紫外吸收峰较强（产品中吸光度达0.013 AU）。

3.4 11 C-CIC的自动化合成

采用全自动合成模块，从11CO2开始到产品合成全部耗时25 min，合成效率为55%～65%（n＞10）。图4a为Semi-HPLC纯化11CCIC的放射性色谱图，可见，在2.5～4.5 min之间为未反应的Triflate-甲烷，产品峰在5～6 min之间。半制备的紫外检测前体在保留时间tR＝3.5～4.5 min时出现，前体被分离，因此产品中没有检查到前体。采用HM-20回旋加速器加速器，束流为40μA，轰击12 min，最终得到3.3 GBq的11C-CIC，比活度为60 TBq／mol。

3.5 11 C-CIC在正常小鼠体内生物分布

11C-CIC在正常小鼠体内的生物分布结果列于表1。经尾静脉注射11C-CIC后，血液清除很快，到5 min时，为（1.86±0.66）%ID／g，到10 min 时 下 降 到 （0.43±0.21）%ID／g，5 min与30 min放射性摄取比为10.9；放射性主要分布在肝、脾和肾内，30 min在肝内放射性仍较高，清除较慢，可能与其脂溶性高有关，全脑摄取较高，在5 min时达（2.78±0.02）ID%／g，到30 min时为（0.52±0.05）%ID／g，5 min与30 min放射性摄取比为5.3，脑内有较好的滞留。

表1 11 C-CIC在正常小鼠体内的生物分布Table 1 The biodistribution of 11 C-CIC in the nor mal NH mice

3.6 Micro PET显像

11C-CIC在正常NH小鼠的PET显像见图5a，放射性主要集中于肝内，双肺区放射性较高，肌肉及大脑内有放射性摄取，该显像与生物学分布一致。大鼠的脑PET显像见图5b，可见30 min时大脑内有明显的放射性摄取，摄取区域为鼠脑白质区（图5b中白色箭头），该摄取即为11C-CIC与CNS白质区髓磷脂结合。

图5 11 C-CIC在正常NH鼠和SD大鼠显像a——Whole body PET i maging of NH mice；b——Brain PET i maging of SD ratFig.5 The PET i maging of 11 C-CIC in NH mice and SD rat

4 结论

本研究自动化合成了11C-CIC，研究了其体外稳定性并进行Micro PET显像。在半制备HPLC流动相及终产品加入10 g／L的抗坏血酸，能有效防止11C-CIC的体外分解。11C-CIC能进入鼠大脑，并被正常的脑白质摄取，提示11C-CIC有可能成为髓鞘斑潜在显像剂。

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