碘标记毒死蜱及其在小鼠体内的生物分布

刁 尧，廖琳丹，王 姝，姜玉艳，张大龙，任 鹏，段弘烨，孟洪颜，刘 博，石文彬，阎 英，李亚明

（1.中国医科大学附属第一医院 核 医学科，辽宁 沈 阳 110001；2.齐齐哈尔市第一医院PET／CT中心，黑龙江 齐 齐哈尔 161000；3.沈阳市苏家屯中心医院 核 医学科，辽宁 沈 阳 110100；4.山东麦德盈华科技有限公司，山东 济 宁 276000；5.沈阳军区总医院 放 疗科，辽宁 沈 阳 110016）

毒死蜱（Chlor pyrif os，CPF），化学名称为0，0-二乙基-0-（3、5、6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯，分子式为C9H11C13NO3PS，相对分子质量为350.6，是目前全球使用广泛的一种有机磷酸醋类农药，既是杀虫剂又是除草剂，常温下毒死蜱为白色结晶固体，溶点为42.5～43℃。文献报道［1－3］毒死蜱具有触杀、胃毒和熏蒸三重作用，可以通过对乙酰胆碱酯酶（Acetylcholine esterase，ACh E）的抑制引起接触者中毒。虽然毒死蜱的药效涉及很多方面，但其在生物体内的具体代谢和分布行为的报道较少，到目前为止，尚未见到用放射性核素标记毒死蜱并观察其生物分布及代谢的文献报道，这妨碍了对毒死蜱相关药效的深入研究。本研究拟采用灵敏的放射性示踪法分析毒死蜱在小鼠体内的分布特点，以揭示其主要的代谢方式。该方法的建立有助于有机磷农药残留检测以及毒死蜱代谢机制研究，同时对于保证食品安全、维护人类健康具有重要的研究价值和应用前景。

1 材料与方法

1.1 主要材料

CPF：Sigma公司（99.9%，HPLC）；Na131I：中国原子能科学研究院；Iodogen：Sig ma公司；K M 小鼠（SYXK（辽）2008-0005）：中国医科大学实验动物中心；γ－计数仪（FJ-2008PS）：西安核仪器厂；磷屏成像仪 PMI 170-9400：Bio-Rad，美国；聚酰胺薄膜：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 131I-CPF制备

毒死蜱（CPE）结构式示于图1。采用Iodogen法对CPF进行131I标记。标记管中预先涂以Iodogen 50μg，向标记管中依次加入50μL的CPF样品（1 mg／mL，DMSO（二甲基亚砜）溶解），10μL 18.5 MBq Na131I，振荡反应10 min，以生理盐水溶解，放置备用。以聚酰胺薄膜为支持介质，以生理盐水为第一展开剂，乙酸乙酯和石油醚（体积比2∶1）为第二展开剂，测定其标记率、放化纯度和比活度。

图1 Chlorpyrifos的分子结构式（＊ 为131I可能标记位点）Fig.1 Chemical structure of Chlorpyrifos（＊labeling site）

1.3 131I-CPF放化纯度的鉴定

采用薄层层析法，吸取碘化反应液2μL，在距聚酰胺薄膜薄层层析板底端1 c m处点样，游离131I－作为对照点样，点样直径0.2 c m，冷风吹干。生理盐水为第一展开剂，上行展开，磷屏成像仪成像；乙酸乙酯和石油醚（体积比2∶1）为第二展开剂，上行展开，磷屏成像仪成像。成像结束后分段剪取聚酰胺层析板，经γ放免计数仪测量放射性计数，计算标记率、放化纯度、放射性比活度和放射性浓度。

标记物的标记率（%）＝（131I-CPF的计数率／点样量总计数率）×100；比活度（TBq／g）＝（放射性核素投入量×标记率）／投入的放射性总量；放射性浓度（GBq／L）＝（放射性核素投入量×标记率）／标记反应总体积。

1.4 131I-CPF的纯化

采用薄层层析法，聚酰胺薄膜薄层层析板，6 c m×20 c m，距底边1.5 c m处铅笔画线设为原点，点样直径为0.2 c m，冷风吹干。生理盐水为展开剂，上行展开。晾干，磷屏成像仪成像，根据已知的Rf值，在原点处刮下聚酰胺粉末（吸附有131I-CPF）置于清洁玻璃小瓶中，DMSO溶解，反复多次，真空泵吹干标记物附着于管壁，DMSO助溶，取2μL进行薄层层析，鉴定放化纯度，纯化后的标记物的放化纯度（%）＝（131I-CPF的计数率／点样量的总计数率）×100。

1.5 131I-CPF体外稳定性

取50μL纯化后的标记物分别加入到100μL生理盐水和新鲜人血清。在37℃下贮存，分别于2、24、48 h取样，聚酰胺薄膜层析测定放化纯度，观察标记物的稳定性。

1.6 131I-CPF的小鼠体内分布

35只K M小鼠（约20 g，4周龄，雄性）随机分为7组（n＝5），各组每只鼠经尾静脉注射200μL131I-CPF（约185 k Bq／只），各组小鼠分别于注射后5、10、30、60、120、240、1 440 min断头处死，取心、肝、脾、肺、肾、肌肉、骨骼、胃、肠、睾丸、脑、脊髓、甲状腺、颌下腺、血，称重，测各个样品放射性计数，计算每克组织摄取放射性占注入量的百分率（%ID／g）。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 131I-CPF的标记率及放化纯度

在以聚酰胺薄膜为支持介质、生理盐水为展开剂的体系中，131I-CPF的Rf值为0～0.1，游离的 Na131I的Rf为0.4～0.5；在乙酸乙酯和石油醚（2∶1）为展开剂的体系中，131I-CPF的Rf为0.9～1.0，游离的 Na131I的Rf为0～0.1。经测定，两种体系条件下131I-CPF的标记率均为93.5%，放化纯度为96.9%，放射性浓度90.24 GBq／L及比活度0.35 TBq／g。

2.2 131I-CPF的体外稳定性

131I-CPF在不同体系中、37℃温度下的稳定性结果示于图2，由图2可见，标记物分别在人血清和生理盐水体系中，37℃下放置48 h，标记物的放化纯度仍大于90%，表明标记物在37℃环境下体外稳定性较好。131I的标记位点分析，131I可能标记在吡啶环上，即I取代 H（＊ 为可能标记位点，图1）。

图2 131I-Chlorpyrifos的体外稳定性Fig.2 Stability of 131I-Chlor pyrifos in vitr o

131I-CPF薄层层析后磷屏成像分布示意图示于图3。

2.3 131I-CPF在小鼠体内生物分布

动物实验结果列于表1。由表1显示，静脉注射给药后131I-CPF在体内分布广泛。血和肾中清除较快，注射后5 min时即达峰值，其放射性摄取率分别为37.27%ID／g和8.50%ID／g；心、肝、脾、肺、小肠、大肠、肌肉和颌下腺中分布均较高，注射后10 min时即达峰值，其放射性摄取率分别为10.86、6.32、7.97、37.12、8.12、8.15、7.04和7.02%ID／g，而后逐渐下降，表明131I-CPF在体内主要经肺、肝、脾、肠道和颌下腺代谢；131I-CPF在脑、脊髓和睾丸中亦有一定分布，注射后10 min时其放射性摄取率分别为4.25、3.41和4.62%ID／g；甲状腺内的放射性随时间的延长而逐渐增加，注射后5 min和24 h其放射性摄取率分别为12.99%ID／g和162.21%ID／g。

图3 131I-Chlor pyrifos薄层层析示意图Fig.3 Chr omatograms of 131I-Chlor pyrifos

表1 131I-Chlor pyrifos在小鼠体内的生物分布，n＝5）Table 1 Biodistribution of 131I-Chlor pyrifos in mice，n＝5）

表1 131I-Chlor pyrifos在小鼠体内的生物分布，n＝5）Table 1 Biodistribution of 131I-Chlor pyrifos in mice，n＝5）

组织8.29±0.85 10.86±1.12 2.51±0.18 2.88±0.23 0.64±0.05 0.21±0.02 0.11±0.02肝4.34±3.42 6.32±1.84 2.48±0.27 1.99±0.21 1.25±0.02 0.22±0.04 0.10±0.01脾5.73±0.62 7.94±1.94 2.05±0.31 2.25±0.22 0.54±0.06 0.15±0.01 0.03±0.01肺20.11±3.74 37.12±3.85 6.81±0.81 4.33±0.47 2.35±0.15 1.16±0.13 0.04±0.01肾8.50±3.65 4.58±1.87 4.35±1.17 2.61±0.82 1.48±0.12 0.69±0.01 0.13±0.01胃3.81±0.34 6.18±0.84 5.41±0.57 2.86±0.14 1.55±0.13 0.26±0.02 0.11±0.01小肠 6.09±0.87 8.12±0.95 3.41±0.35 5.45±0.63 1.38±0.12 0.34±0.05 0.05±0.01大肠 5.25±0.42 8.15±0.75 3.34±0.44 2.07±0.24 0.44±0.05 0.13±0.03 0.02±0.01骨2.02±0.32 2.94±0.35 2.04±0.31 1.48±0.18 0.32±0.02 0.09±0.01 0.02±0.01肌6.18±0.95 7.04±1.11 4.48±0.55 3.23±0.43 1.13±0.19 0.61±0.05 0.03±0.01血37.27±4.77 23.76±4.46 13.45±2.55 9.51±2.12 4.17±0.66 1.35±0.18 0.56±0.03脑2.05±0.49 4.25±0.53 3.79±0.42 1.38±0.08 0.52±0.02 0.32±0.01 0.01±0.01脊髓 1.85±0.21 3.41±0.23 2.65±0.16 1.17±0.11 0.32±0.02 0.22±0.01 0.01±0.01颌下腺 4.72±1.23 7.02±2.81 3.92±0.51 2.96±0.64 0.56±0.04 0.14±0.01 0.02±0.01睾丸 1.32±0.12 4.57±0.94 3.12±0.22 1.47±0.13 0.24±0.02 0.11±0.01 0.03±0.01甲状腺 12.99±4.45 14.58±3.26 22.22±4.58 32.98±5.6不同时间（min）各组织的放射性摄取率／（%ID·g－1）5 10 30 60 120 240 1 440心6 77.21±9.54 132.36±18.65 163.65±23.54

3 讨论

机体内与有机磷农药代谢密切相关的胆碱酯酶有乙酰胆碱酯酶（ACh E）、丁酰胆碱酯酶（Butyrylcholinesterase，Bu Ch E，又称假性胆碱酯酶）和羧酸酯酶（Car boxylesterase）等，其中ACh E又称真性胆碱酯酶，主要作用于乙酰胆碱，ACh E主要分布于神经肌肉组织、红细胞及血小板中，是有机磷农药共同的作用靶点，活性部位丝氨酸残基与有机磷结合后活性被抑制，其活性抑制是有机磷农药中毒的主要机制，也是评价有机磷农药中毒程度的一个重要生物标志［4－5］。

毒死蜱进入机体后要先经氧化酶的代谢活化作用生成活性中间产物，即毒死蜱氧化物才能作用于靶组织中的ACh E发挥毒作用，造成胆碱受体功能紊乱，使有胆碱受体的器官功能发生障碍，氧化后的毒死蜱经对氧磷酶（paraoxonase-1，PON-1）等水解酶的作用，降解生成解毒后的代谢产物，即磷酸二乙酯（diethylphosphate，DEP）和3，5，6－三氯-2-吡啶（3，5，6-trichlor opyridinol，TCP）［6－7］。

本实验制备的131I-Chlorpyrif os标记物体外稳定性实验结果显示，标记后48 h的放化纯度大于90%（溶于新鲜人血清中），适于Chlorpyrif os在体内外的微量示踪研究，为下一步研究提供了可靠保障。利用131I-Chlorpyrif os具有灵敏准确的放射性示踪特点，可用于观察分析其在整体生物体内的代谢过程和可能的作用靶点。

分布实验的结果显示，静脉注射后131IChlor pyrif os在体内广泛分布，主要分布于心、肝、脾、肺、小肠、大肠、肌肉和颌下腺中，其中，以肺分布最多，肾、小肠、大肠、肌肉和颌下腺次之，说明肺脏等诸多器官对Chlorpyrif os具有很高的摄取率，这可能是毒死蜱与肺癌的发生可能存在某些联系的原因之一［8］，肾、肝脏是其主要的代谢脏器，此结果提示碘标131I-Chl orpyrifos可为探讨Chlorpyrif os分布代谢的研究提供一个灵敏的分析方法。Chlor pyrif os在脑、脊髓中亦有一定分布，揭示其能够透过血脑屏脏（BBB），与文献报道一致［9－11］。

131I-Chlorpyrif os在甲状腺内的放射性随时间的延长而逐渐增加，反映出其在体内有一个渐进性的脱碘过程，也证明了毒死蜱进入体内后存在氧化过程；同时体外稳定性实验结果也显示其在生理盐水中稳定，从分子结构分析，其分子结构存在的吡啶环结构使得整个分子呈脂溶性，这是分子易于透过BBB的重要原因之一，也是其在生理盐水中稳定的原因之一，所以本实验采用DMSO溶解效果较生理盐水好。

以往研究毒死蜱体内代谢及分布实验，大都采用液相色谱等方法，组织样品处理时比较繁琐［5－7］，而用碘标的131I-Chl or pyrif os研究代谢实验时，组织样品无需特殊处理，直接测量即可灵敏地反映其在小鼠体内的基本代谢过程，若进一步结合其他分子生物学技术还可分析其在体内精确的代谢行为及可能的作用机制。

［1］ Ma T，Chambers J E.Kinetic parameters of desulf uration and dearylation of parathion and chlor-pyrif os by rat liver microso mes［J］.Food Chem Toxicol，1994，32（8）：763-767.

［2］ Pond A L，Chambers H W，Coyne C P，et al.Purification of t wo rat hepatic proteins with A-esterase activity toward chlorpyrifos-oxon and paraoxon［J］.J Phar macol Exp Ther，1998，286（3）：1 404-1 411.

［3］ 周志荣，林少彬.血、尿中有机磷农药及其代谢产物检测方法的研究进展［J］.国外医学卫生学分册，2007，34（3）：153-157.

［4］ Ti mchalk C，Nolan R J，Mendrala A L，et al.A Physiologically based phar maco-kinetic and pharmacodynamic PBPK／PD model for the organophosphate insecticide chlorpyrifos in rats and humans［J］.Toxicol Sci，2002，66（1）：34-53.

［5］ Ti mchalk C，Poet T S.Develop ment of a physiologically based phar macokinetic and phar macodynamic model to deter mine dosi metry and cholinesterase inhibition for a binary mixture of chlorpyrif os and diazinon in the rat［J］.Neurotoxicol，2008，29（3）：428-443.

［6］ 吴惠，乙楠楠，刘沛，等.大鼠急性经口暴露毒死蜱的毒物代谢动力学和毒物效应动力学研究［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2014，34（5）：592-596.

［7］ Smith J N，Campbell J A，Busby-Hjerpe A L，et al.Co mparative chlor pyrifos phar macokinetics via multiple routes of exposure and vehicles of ad ministration in the adult rat［J］.Toxicology，2009，261（1-2）：47-58.

［8］ Alavanja M C，Dosemeci M，Samanic C，et al.Pesticides and lung cancer risk in the agricultural health study cohort［J］.Am J Epidemiol，2004，160（9）：876-885.

［9］ Moore C A，Wilkinson S C，Blain P G，et al.Percutaneous absor ption and distribution of organophosphates （chlorpyrif os and dichlorvos）f ollowing der mal exposure and decontamination scenarios using in vitro hu man skin model［J］.Toxicol Lett，2014，229（1）：66-72.

［10］Solo mon K R，Williams W M，Mackay D，et al.Properties and uses of chlorpyrifos in the United States［J］.Rev Envir on Contam Toxicol，2014，231：13-34.

［11］Zhao Q，Dourson M，Gadagbui B.A review of the reference dose f or chlor pyrifos［J］.Regul Toxicol Phar macol，2006，44（2）：111-124.