125I标记的二噻吩查尔酮类Aβ斑块显像剂的制备与生物评价

彭 程，崔孟超，梁志刚，刘亭廷，张晓阳

（1.首都医科大学 宣 武医院，北京 100053；2.放射性药物教育部重点实验室 北 京师范大学 化 学学院，北京 100875）

阿尔兹海默症（AD）是一种常见痴呆症，Aβ斑块是其重要病理学特征之一［1］，以之为靶点开发放射性分子探针，进而通过PET或SPECT核医学显像技术有可能实现对AD的早期诊断［2］。近年来已经有多个用于PET显像的Aβ斑块分子探针得到美国FDA批准进入临床应用，而用于SPECT显像的Aβ斑块分子探针的研发则滞后，至今只有［123I］I MPY进入过临床实验［3］。2005年，Nesterov等［4］报道了一个含有二噻吩结构单元的小分子（NIAD-4）作为检测Aβ斑块的近红外光学探针，随后Nilsson等［5］报道了一系列多聚噻吩衍生物（LCPs）作为对蛋白质构象敏感的光学探针，这两类探针不仅在体外与Aβ聚集体具有很高的亲和力，而且能有效通过血脑屏障，与AD转基因小鼠脑内的Aβ斑块结合。此后，崔孟超等［6－7］报道了两类含有二噻吩结构的 Aβ斑块显像剂，分别将二噻吩结构单元与苯并噻唑和苯乙烯这两类经典的Aβ斑块分子探针骨架结构相连，并进行了125I放射性标记，体内外生物评价均显示优良性质。可见二噻吩结构单元在与Aβ斑块结合的过程中可能起着非常重要的作用。近年来，Ono等报道了一系列放射性标记的查尔酮（Chalcone）衍生物作为Aβ斑块显像剂，大多具有对Aβ聚集体较高的亲和力，而且在正常小鼠脑内具有较高的初始摄取，查尔酮成为一类新型的Aβ斑块分子探针骨架结构［8－10］。

本研究拟利用组合化学原理，将二噻吩结构单元与查尔酮结构连接，设计并合成两个卤代二噻吩查尔酮衍生物作为Aβ斑块显像剂，利用体外荧光染色实验和竞争结合实验评价其与Aβ聚集体的亲和力，对碘代化合物进行125I放射性标记，并进行体外放射自显影实验和正常小鼠体内分布实验。

1 主要实验材料

1.1 试剂和仪器

4－甲氧基苯乙酮：国药集团化学试剂有限公司；化合物2，3参照文献［6］制备；Na125I（2 200 Ci／mmol）：美国 Perkin-El mer公司；硫磺素-S：Sig ma-Al drich公司；Aβ1－42多肽：日本Osaka peptide institute（三氟乙酸盐形式）；其他试剂均购自北京化工厂。

400 MHz核磁共振谱仪：Bruker AvanceⅢ；质谱仪：Ther mo Surveyor MSQ Plus（EI）；SCL-10 AVP型高效液相色谱仪：配有Packard 500 TR型γ射线闪烁检测器，岛津；奥泰-626型高效液相色谱仪：配有LINEAR UVIS-201型紫外检测器以及BIOSCAN型γ射线闪烁检测器；Agilent TC-C18反相柱（5μm，4.6 mm×150 mm）；Alltech C18反相柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；Axio Oberver Z1（Zeiss，Ger many）荧光显微镜，Per kin-El mer储磷屏成像系统。

1.2 实验动物

正常小鼠：ICR，5周，雄性，购自北京大学实验动物中心。转基因小鼠：C57BL6，APP-swe／PSEN1，12月龄，购自中国医学科学院实验动物研究所。

2 实验方法

2.1 稳定化合物及标记前体的合成

合成路线及标记方法如图1所示。

2.1.1 （E）-3-（5-［5′-溴-2，2′-二噻吩）-1-（4-甲氧基苯基）-2-烯-1-丙酮 （化合物4）

称取150 mg对甲氧基苯乙酮（化合物1，1.0 mmol）和273 mg溴代二噻吩醛（化合物2，1.0 mmol）溶于50 mL乙醇中，滴加50μL氢氧化钠水溶液（1 mol／L）；室温下搅拌30 min后有大量橙色固体析出；抽滤，并用20%乙醇水溶液洗涤三次，干燥后得到295 mg橙色化合物，产率为73%。

图1 合成路线及标记方法Fig.1 Synthetic route and r adiolabeling method

2.1.2 （E）-3-（5-［5′-碘-2，2′-二噻吩］）-1-（4-甲氧基苯基）-2-烯-1-丙酮（化合物5）

制备方法与化合物4类似，化合物1与化合物4反应，干燥后得到132 mg橙色化合物，产率为86%。

2.1.3 （E）-3-（5-［5′-三 丁 基 锡-2，2′-二 噻吩］）-1-（4-甲 氧 基 苯 基）-2-烯-1-丙 酮 （化 合物6）

将121 mg化合物4（0.3 mmol）、0.3 mL六正丁基二锡和35 mg四（三苯基磷）钯（0.03 mmol）溶于10 mL甲苯中（含1 mL三乙胺）。110℃油浴中搅拌加热反应10 h。减压除去溶剂，残余物经硅胶柱层析分离V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）＝4∶1得到50 mg黄色蜡状固体，产率为27%。

2.2 放射性标记及生物评价

2.2.1 ［125I］5的制备

称取0.1 mg锡标记前体化合物6于安剖瓶中，加入100μL乙醇溶解，用微量进样器加入约4μL［125I］NaI溶液（300μCi，比活度：542.7 TBq／g）。依次加入50μL H2O2（3%），100μL盐酸（1 mol／L）。密闭后室温下反应15 min后，加入50μL饱和亚硫酸氢钠溶液终止反应，饱和碳酸氢钠溶液调p H至中性。乙酸乙酯萃取（3×1 mL）分液，有机相用氮气吹干，残余物用100μL乙醇溶解后进HPLC分离，分离条件为：Alltech C18 analytical col u mn（4.6 mm×250 mm）；CH3CN／H2O＝9／1；流速1.0 mL／min。

收集含有目标物的流出液，旋蒸除去溶剂，将得到的标记配体溶于少量乙醇并用生理盐水配制成所需要的浓度置于－20℃中存储待用。最后通过HPLC分析125I标记配体与参比化合物的保留时间。［125I］5的分析条件如下：Agilent TC-C18 analytical colu mn（4.6 mm×150 mm）；V（CH3CN）∶V（H2O）＝9∶1；流速1.0 mL／min。

2.2.2 体外荧光染色

转基因小鼠及正常小鼠大脑石蜡切片（8μm）依次经过3×20 min的二甲苯脱蜡，2×5 min 100%乙醇，2×5 min 95%乙醇，5 min 80%乙醇和5 min 70%乙醇洗涤，流水冲洗10 min后，浸于化合物4或5（1μmol／L，20%乙醇）溶液中10 min，切片经过50%乙醇洗涤2 min、去离子水洗涤2 min后，采用荧光微镜观察，使用GFP滤镜。硫磺素-S对照染色与上述方法相同，使用质量分数为0.125%的硫磺素-S水溶液。

2.2.3 体外放射自显影

转基因小鼠脑石蜡切片及对照正常小鼠脑石蜡切片经二甲苯脱蜡后，滴加纯化后的［125I］5溶液（约370 k Bq／100μL），室温下孵育60 min。用40%的乙醇溶液冲洗切片3 min，干燥后在磷屏上曝光6 h后进行成像分析。同一切片经过硫磺素-S染色后与放射自显影实验结果进行对照。

2.2.4 体外竞争结合实验

硅烷玻璃试管中依次加入放射配基（［125I］TZDM，100 000 min－1／100μL，10%乙醇），化合物4或5溶液（终浓度范围：10－4～10－11mol／L），Aβ1－42聚集体（终浓度：28 n mol／L），用PBS（含10%乙醇）定容至1 mL；37℃水浴中震荡孵育2 h；细胞收集器分离结合复合物与游离放射配基（GF／B滤纸用0.5%PEI浸泡2 h）；Wizard 1470型伽玛计数仪测定滤膜上放射性计数；利用Graph Pad Pris m 4.0分析数据得到半抑制常数IC50；根据Cheng-Prusoff方程计算抑制常数Ki＝IC50／（1＋［L］／Kd）［11］。

2.2.5 正常小鼠体内生物分布

将5μCi纯化后的［125I］5（100μL生理盐水，含10%乙醇）由尾静脉注射入四组正常ICR小鼠体内（n＝5），分别于2、30、60、120 min断头处死，解剖取出其脏器，测量脏器湿重及放射性计数，计算其放射性百分计量（%ID／organ）及每克脏器中的放射性摄取率（%ID／g）。

3 结果与讨论

3.1 稳定化合物及标记前体的合成

合成的化合物均经过核磁共振（1H NMR）与质谱（EI-MS）的表征。

（1）化合物4的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ8.02（d，J＝8.8 Hz，2 H），7.86（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.30（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.23（d，J＝3.5 Hz，1H），7.08（d，J＝3.7 Hz，1H），7.03－6.95（m，4 H），3.89（s，3 H）.MS（EI）：m／z calcd f or C18H13Br O2S2403.95；f ound 404.13。

（2）化合物5的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ8.02（d，J＝8.9 Hz，2 H），7.86（d，J＝15.4 Hz，1 H），7.29（d，J＝15.2 Hz，1 H），7.23（d，J＝3.8 Hz，1 H），7.19（d，J＝3.8 Hz，1 H），6.98（d，J＝8.9 Hz，1 H），6.92（d，J＝3.8 Hz，1 H），3.90（s，3 H）.MS（EI）：m／z calcd f or C18H13IO2S2451.94；f ound 452.04。

（3）化合物6的表征。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ7.40（d，J＝7.9 Hz，2 H），7.21（d，J＝5.0 Hz，1 H），7.18（d，J＝2.7 Hz，1 H），7.07（s，1 H），7.04（d，J＝15.4 Hz，1 H），6.92（d，J＝3.7 Hz，1 H），6.89（d，J＝8.0 Hz，2 H），6.85（d，J＝15.2 Hz，1 H），3.83（s，3 H），1.73－1.58（m，6 H），1.41－1.28（m，6 H），1.06－1.20（m，6 H），0.92（t，J＝7.3 Hz，9 H）.MS（EI）：m／z calcd for C30H40O2S2Sn 616.15；found 616.53。

3.2 ［125I］5的制备

经过锡－卤交换法成功进行了125I标记，标记率大于99%，通过HPLC分离纯化去除标记前体及无机盐等杂质后得到［125I］5，经HPLC分析其放化纯度大于99%。［125I］5与稳定化合物5在相同条件下进行HPLC共进样分析，二者保留时间分别为4.28 min和4.80 min，能够很好地匹配，［125I］5的结构得到认证。

3.3 体外荧光染色

所合成化合物4和5均能清晰地标记出转基因小鼠脑切片上Aβ斑块的位置，而且可以与相邻切片经硫磺素-S染色的结果对应（见图2），表明两个化合物与Aβ斑块均有较好的亲和力和选择性。

图2 化合物4（a）和5（c）在转基因小鼠脑切片上的荧光染色结果t he adjacent sections were stained wit h t hio avin-S（b，d）.（10×magnification）Fig.2 Fluorescence staining of 4（a）and 5（c）on brain sections from Tg mouse

3.4 体外竞争结合实验

以［125I］TZDM为放射性配基进行的体外竞争结合实验表明，合成的化合物4和5均能对［125I］TZDM 与 Aβ1－42聚集体的结合产生显著的抑制作用（见图3），经过定量计算得到化合物4和5的Ki值分别为2.33 n mol／L和0.88 n mol／L，表明两个化合物对 Aβ1－42聚集体均有很高的亲和力，且碘代化合物5比溴代化合物4的亲和力更高，因此，选择化合物5进行进一步的125I标记和生物评价。

3.5 体外放射自显影

标记化合物［125I］5在转基因小鼠脑切片上有明显的放射性浓集（图4），而同龄正常小鼠脑切片上无放射性浓集，表明该化合物能与转基因小鼠脑内的Aβ斑块进行特异性结合，且自显影结果能与相同切片经硫磺素-S染色结果相对应，表明［125I］5与Aβ斑块具有较高的亲和力和选择性。

3.6 正常小鼠体内生物分布

［125I］5在正常ICR小鼠体内的分布如表1所示，标记化合物在小鼠脑内的2 min初始摄取为（1.19±0.09）%ID／g，到30 min时即清除至（0.36±0.09）%ID／g，可见其初始脑摄取不是很高，但清除速率较快（2 min与30 min脑摄取比值为3.3）。此外，［125I］5在肝脏中有较高的初始摄取和显著的代谢。

图3 化合物4和5对［125I］TZDM与Aβ1－42聚集体结合的抑制曲线Fig.3 Inhibition curves for the binding of［125I］TZDM to Aβ1－42 aggregates

图4 放射性自显影a——［125I］5；b——t hioflavin-S；c——wild-type mouseFig.4 In vitro autoradiography studies of［125I］5 on brain sections

表1 ［125I］5在正常小鼠体内的生物分布（¯x＋s，n＝5）Table 1 Biodistribution in nor mal mice after i.v.injection of［125I］5（¯x＋s，n＝5）

3 结论

本研究成功制备了两个卤代二噻吩查尔酮类Aβ斑块分子探针，体外荧光染色实验和体外竞争结合试验均证实与Aβ1－42聚集体有很高的亲和力。通过锡－卤交换法成功对碘代化合物5进行了125I标记，体外放射自显影实验显示［125I］5能够特异性地标记AD转基因小鼠脑Aβ斑块，并与硫磺素-S的染色结果对应。正常小鼠生物分布结果表明，［125I］5穿过血脑屏障的能力较弱，2 min时的脑放射性摄取率为1.19%ID／g，与［125I］I MPY相比（2 min脑摄取值为2.88%ID／g）还有很大差距，但脑清除速率较快。综上所述，［125I］5具有成为Aβ斑块显像剂潜力，但需要进一步结构修饰以提高初始脑摄取。

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