不同制法纳米银的抗真菌活性研究

张璐璐，苗 琦，叶招浇，李洪娇，姜远英，曹永兵（.第二军医大学药学院，上海 004；.福建中医药大学药学院，福州 5008；.第二军医大学附属长海医院口腔科，上海 004）

・论著・

不同制法纳米银的抗真菌活性研究

张璐璐1，苗 琦1，叶招浇2，李洪娇3，姜远英1，曹永兵1（1.第二军医大学药学院，上海 200433；2.福建中医药大学药学院，福州 350108；3.第二军医大学附属长海医院口腔科，上海 200433）

目的探讨不同制备方法得到的纳米银的体外抗真菌活性。方法 采用微量液基稀释法测定纳米银对氟康唑不同敏感型白色念珠菌的最低抑菌浓度；棋盘实验测定纳米银与氟康唑的协同抗真菌作用。结果 不同制备方法得到的纳米银对白色念珠菌的抑制作用不同，对敏感菌与耐药菌的抑制作用无显著差异，与氟康唑合用对白色念珠菌能产生协同作用。结论 不同制备方法得到的纳米银在体外的抗真菌作用有差异，但与氟康唑合用可产生协同作用。

纳米银；白色念珠菌；抑菌作用

现代研究发现，银有杀菌作用。很早以前人们就利用银来加速伤口愈合、治愈感染、净化水和保存食物、饮料等［1］。纳米级的银具有稳定的化学性质，在电学、光学和催化等诸多方面具有十分优异的特性。在生物学方面，很高的比表面积使得纳米银粒子与微生物表面接触的概率大大增加，抗菌性能远大于传统的银系抗菌剂［2，3］。目前，已有纳米银应用于烧伤创面的敷料［4］及软衬材料的报道［5］。近年来，真菌感染率不断上升，在深部真菌感染中，念珠菌是最常见的病原菌［6］。本研究以白色念珠菌为研究对象，探讨不同制备方法得到的纳米银对白色念珠菌生长抑制作用的差异。

1 仪器与材料

1.1 仪器 THZ-82A台式恒温振荡器（上海跃进医疗器械厂）；SW-CT-IF型单人双面超净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；XW-80A漩涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；UV-2802型紫外可见光分光光度计（UNIC）；96孔细胞培养板（丹麦Nunclon公司）。

1.2 材料 纳米银；0.9%生理盐水；AgNO3；AgCl；氟康唑（fluconazole）注射液（上海信谊金朱药业有限公司）。

RPM I1640液体培养液：RPM I1640（GibcoBRL）10 g、NaHCO3 2 g、吗啡啉丙磺酸（MOPS，Sigma公司）34.5 g（0.165 mol／L），加三蒸水900 m l溶解，用NaOH调pH值至7.0（25℃），三蒸水定容至1 000 m l，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA）：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、琼脂18 g，加三蒸水900 m l溶解，加入2 mg／m l氯霉素水溶液50 m l，调整pH值至7.0，定容至1 000 m l，高压灭菌，4℃保存。

YEPD培养液：酵母浸膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，加三蒸水900 m l溶解，加入2 mg／m l氯霉素水溶液50 m l，三蒸水定容至1 000 m l，高压灭菌（121℃，15 m in），于4℃保存备用。

YEPD固体培养基：酵母浸膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，加三蒸水900 m l溶解，加入2 mg／m l氯霉素水溶液50 m l，三蒸水定容至1 000m l，高压灭菌（121℃，15min），趁热将液体铺于无菌的平皿（直径9 cm）中，于4℃保存备用。1.3 菌株 白色念珠菌（Candida albicans）SC5314由W illiam A Fonzi教授惠赠；白色念珠菌（Candida albicans）Y0109由第二军医大学附属长征医院真菌室提供；白色念珠菌（Candida albicans）100、103由第二军医大学附属长海医院真菌室提供，所有菌株均经形态学和生化学鉴定。

2 实验方法

2.1 纳米银的制备 两种方法分别命名为W法和D法，得到的纳米银溶胶分别命名为AgW和AgD。

W法［7］：称取硝酸银0.037 g加去离子水100 m l溶解，称取柠檬酸三钠0.26 g加去离子水26 m l溶解。取100 m l硝酸银溶液与2.6 m l柠檬酸三钠溶液混合，置于微波炉中以中高火加热6 m in，得到灰绿色溶胶，冷却至室温，避光保存。

D法［8］：称取90 mg硝酸银溶于500 m l去离子水中加热至沸腾，逐滴加入1%的柠檬酸钠10 m l，保持沸腾，同时剧烈搅拌1 h，继续搅拌至溶液冷却，得到黄绿色的银溶胶，冷却后避光保存。

2.2 微量液基稀释实验

2.2.1 药敏板的制备 将白色念珠菌SC5314、Y0109、103、100以1∶100接种至1 m l YEPD培养液，于30℃、200 r／m in培养箱中振荡培养16 h，活化2次，使真菌处于指数生长期后期。用血细胞计数板计数，用RPM I1640培养液将菌液浓度调整至（1～5）×103cfu／m l。取无菌96孔板，于每排1号孔加RPM I1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液和药物溶液共200μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作为阳性生长对照。2～11号孔进行倍比稀释。

2.2.2 最低抑菌浓度（M IC）的判定 在30℃恒温培养箱中培养，用酶标分析仪分别测定24 h和48 h各孔在630 nm波长处的消光度（OD值）。阳性对照孔的OD值控制在0.2左右，与阳性对照孔对比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为M IC80（真菌生长80%被抑制时的药物浓度）。当药物的M IC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：M IC80值高于最高浓度64μg／m l时，计为“＞64μg／m l”；M IC80值为最低浓度或在最低浓度以下时，均计为“≤0.125μg／m l”。上述实验均平行操作3次。

2.3 棋盘式微量稀释实验

2.3.1 药敏板的制备 合用的2种药物于96孔板上以二维棋盘的纵（A～H）、横（2～11）两方向分别进行2倍的倍比稀释。使得氟康唑的终浓度为16、8、4、2、1、0.5μg／m l（敏感菌）；0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6、0.007 8、0.003 9μg／m l（耐药菌），纳米银的终浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg／m l。实验所用试剂、药物、实验操作步骤同上述体外药敏实验。

2.3.2 联合用药的效果评价 部分抑菌浓度指数（FICI）是评价联合用药的两药相互作用方式的主要参数。抑菌浓度分数（FIC），分别为每一种药物联合抑菌时所需M IC与单用时M IC的比值。而FICI则等于两种药物FIC之和，即FICI＝ΣFIC＝FICA＋FICB＝CA联用／M ICA单用＋CB联用／M ICB单用，M ICA和M ICB分别是药物A和B单用时的M IC值，CA和CB为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。当M IC值高于检测最高限时，以最高限浓度的2倍值用以计算FICI。很多文献报道，当FICI≤0.5时，两药的相互作用确定为协同作用，且FIC指数越小，协同作用越强；0.5＜FICI≤1时，两药的相互作用为相加；1＜FICI≤4时，为无关作用；当FICI＞4时，两药产生拮抗作用。

3 结果

3.1 纳米银颗粒的形态观察

3.1.1 粒径 两种方法制备的纳米银溶胶经上海材料研究所检测中心检测。AgW中纳米银颗粒的平均粒径为105.8 nm，AgD中纳米银颗粒的平均粒径为64.2 nm。

3.2 微量液基稀释实验 AgW对氟康唑敏感菌株白色念珠菌SC5314、Y0109于24、48 h的M IC80为0.25、4μg／m l，对氟康唑耐药菌株白色念珠菌100、103于24、48 h的M IC80为1、4μg／m l；AgD对不同敏感性的菌株没有抑制作用（表1）。纳米银对敏感型白色念珠菌的抑制作用弱于氟康唑，对耐药菌则表现出较氟康唑更低的M IC80值。

3.3 棋盘式微量液基稀释实验 对氟康唑不同敏感性的菌株，AgW、AgD与氟康唑联合使用均可产生协同作用。AgW与氟康唑联用，两者的M IC80值均有不同程度的下降，并且氟康唑的用量显著下降。单用无抑菌作用的AgD在与氟康唑合用后，FIC＜0.5，表现出协同作用，且两药的用量均明显减少（表2）。从单用的结果看，W法制备的纳米银其抑菌效果要远优于D法。与氟康唑合用后，D法制备的纳米银的用量明显降低，可与氟康唑产生协同抗真菌的作用，但协同的用量仍高于W法制备的纳米银。综上所述，W法制备的纳米银有更好的抗真菌作用。

表1 两种纳米银溶胶对白色念珠菌不同菌株药敏试验的M IC80值（ρB／μg・m l－1）

表2 两种纳米银溶胶与氟康唑合用对白色念珠菌的作用（ρB／μg・m l－1）

4 讨论

纳米银的抗真菌机制复杂，主要包括银的金属离子作用和光催化作用。多数学者认为银离子在纳米银的杀菌过程中发挥了不可忽视的作用。目前，已报道的机制主要包括银离子与菌体中的酶蛋白巯基（-SH）结合，使一些以此为必要基团的酶失去活性，致使细胞丧失分裂增殖能力而死亡。Feng等［9］发现银离子可与致病菌中的DNA碱基相结合形成交叉链接，进而置换嘌呤和嘧啶中与氮相邻的氢键，使真菌的DNA结构发生改变，丧失复制能力，导致致病菌失去增殖能力，从而达到杀灭真菌的作用。而Kim等［10］的观点则认为纳米银与真菌表面的蛋白质分子发生结合，使蛋白质变性，质子泵裂解，膜蛋白或磷脂双分子层的通透性增强，H＋容易外漏，导致真菌的细胞膜裂解而发挥杀菌作用。

本实验结果表明，不同制备方法得到的纳米银对白色念珠菌的抑制作用不同，这种抑制作用在不同敏感性的白色念珠菌中没有明显差异。此外，纳米银的粒径不同，抗菌效果也存在差异，根据本实验结果，纳米银的粒径越大，抗菌效果越好。目前，纳米银粒径与抗菌效果的关系仍未见文献报道，可作为今后研究的方向。

目前，抗真菌药物种类有限，耐药真菌的出现给临床治疗带来更大的挑战［11］。因此，低耐药性、高安全性的纳米材料在抗真菌药领域值得进一步研究。

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Fungistasis of nanometer silvers synthesized by differentmethods on Candida albicans

ZHANG Lulu1，M IAO Qi1，YE Zhaojiao2，LIHongjiao3，JIANG Yuanying1，CAO Yongbing1（1.Schoolof Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai 200433，China；2.School of Pharmacy，FuJian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China；3.Department of Stomatology，Changhai Hospital A ffliated to Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo explore the in vitro fungistasis of nanometer silversmade by differentmethods on Candida albicans.MethodsThem inimal inhibitory concentrations（M ICs）of Candida albicans strains stimulated to silver nanoparticles were determ ined by m icrodilutionmethod.The combination effects of silver nanoparticles w ith fluconazole were determ ined by chess board check assay.ResultsThe inhabitation effect of two kinds of silver nanoparticles were different on the grow th of Candida albicans.Silver nanoparticles had a synergistic effect w ith fluconazole on Candida albicans.ConclusionThe two kinds of silver nanoparticles had various antifungal activities in vitro and had a synergistic effect w ith fluconazole on Candida albicans.

silver nanoparticles；Candida albicans；fungistasis

R978.5

A

1006-0111（2015）04-0328-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.010

2014-03-11

2015-01-14［本文编辑］李睿旻

张璐璐，硕士研究生.Tel：15000621731；E-mail：594361017＠qq.com

曹永兵，教授.研究方向：真菌耐药，中药抗肿瘤.Tel：13386270390