醋酸菌冷冻、冷干保护剂的选择

王娜，国石磊，张永祥，彭利沙，李军

1(河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛，066600)2(河北省果品加工工程技术研究中心，河北秦皇岛，066600)

醋酸杆菌是一类重要的工业用菌，在食品和饮料工业生产以及工业化学品的生物转化中都起着重要作用［1］。

低温冷冻保藏是一种长期保藏菌种的简便方法。菌悬液中加入适当保护剂放于冰箱中保存，一般－20℃下能保藏1年左右，－70℃下保藏时间更长，可达到10年以上，此保藏方法简单易行，适合实验室保藏菌种［2］。而冷冻干燥保藏菌种的方法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般活力强的微生物及其孢子以及无芽孢菌都适用，适用于菌种的长期保存，一般可保存数年至十余年。

保护剂无论对生物体还是生物大分子都有良好的非特异性保护作用，能够显著降低工艺处理中冷冻、干燥等逆境对菌体细胞膜、脂质体等造成的伤害，提高菌种存活率［3］。采用合适的保护剂加以深冷技术能有效地保藏菌种，制备发酵剂［4］。国内外关于保护剂在乳酸菌中的保护作用已有大量的研究，并且对各种保护剂的效果也有大量的数据报道［5－11］，但是针对醋酸菌保护剂的研究较少。研究表明，不是每种保护剂对所有菌种都有保护作用，由于细胞结构和大小都存在差异，不同微生物即使采用相同的保护剂所取得的效果也不尽相同［12］，不同的保护剂所发挥的效果具有菌株特异性的特点。

糖醇类物质是一类重要的保护剂，它们的共同点是有大量自由羟基，可与菌表面自由基联结，形成保护膜，从而避免菌体暴露在介质中，还可与蛋白质形成氢键以取代水，保证蛋白质结构的稳定性［13］。同时糖醇类物质也可以降低冰晶体对菌体细胞的破坏作用，有利于细胞较快复水或修复受损细胞［14］。海藻糖作为一种广泛存在于细菌、真菌、植物及很多无脊椎动物细胞内的非还原性二糖，具有高亲水、化学稳定的独特性质［15］。除此以外，常用作糖类保护剂的还有葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、葡聚糖等。高分子保护剂，如脱脂奶粉等溶于水时，溶液可呈过冷状态，即在冰点以下的相同温度该溶液中的溶质浓度较小，蛋白质盐析变性也较少［16］。脱脂奶粉是一种较好的保护剂，其主要成分是蛋白质和糖类，特别是其中的乳清蛋白和乳糖能对菌种产生较好的保护作用，能以“包埋”的形式将菌体与外界不利环境隔离，减少由于细胞壁损坏而引起的胞内物质泄漏，从而起到保护作用。

为了考察不同保护剂对醋酸菌菌体细胞的保护作用，本文以醋化醋杆菌和巴氏醋杆菌巴士亚种为研究对象，比较10种不同的保护剂对它们的冷冻和冷干保护作用，为进一步研发保护剂配方提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

醋化醋杆菌(Acetobacter aceti，CICC 22519)，巴氏醋杆菌巴士亚种(Acetobacter pasteurianus ssp.pasteurianus，CICC7015)，均购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

液体活化培养基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，蒸馏水100 mL，pH自然，121℃灭菌20 min。

液体种子培养基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，蒸馏水100 mL，pH自然，121℃灭菌20 min。

液体发酵培养基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，Mg-SO4·7H2O 0.1 g，蒸馏水100 mL，pH 自然，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 保护剂

葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、可溶性淀粉、葡聚糖、玉米糊精均为分析纯试剂和生化试剂。脱脂乳粉为市售奶粉。

1.1.4 主要仪器与设备

FDU-1200型冷冻干燥机，日本EYELA东京理化;VOS301SD型真空干燥箱，日本EYELA东京理化;蒸汽灭菌锅、生化培养箱和洁净工作台等实验室常用仪器设备。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液制备

为确保实验的一致性，每次培养前均从固体斜面培养上接种活化，30℃、170 r/min，振荡培养24 h。随后以10%接种量再次接入液体培养基，如前，培养24 h。所得到的液体种子培养物接种于100 mL液体发酵培养基中，30℃培养36 h至细胞稳定期。在无菌条件下，将培养物等量分装于10 mL无菌离心管中，5 000 r/min离心10 min，迅速倾去上清液，收集细胞，用冷的磷酸缓冲溶液(pH 7.0)洗涤2次，再次离心收集。所得的菌体细胞加入等量的不同保护剂和磷酸缓冲溶液中，用涡旋混合器充分混匀后进行冷冻或冷干处理。

1.2.2 保护剂制备

将各种保护剂按要求用蒸馏水溶解，配制成质量浓度为10%的溶液，113℃灭菌40 min后备用。

1.2.3 菌体存活率测定

菌体存活率:稀释平板计数法，样品经适当倍数稀释后涂布于固体琼脂培养基上，每个稀释度做3个重复，平皿置30℃培养48 h后菌落计数。

1.2.4 冷冻

经过不同保护剂悬浮的菌悬液置于－20℃下冻存12 h，室温解冻后测定活菌数。

1.2.5 冷冻干燥

添加有不同保护剂的菌悬液均分装于10 mL无菌离心管中，置冷冻干燥机中处理24 h。测定活菌数前先用磷酸缓冲溶液对处理后的样品定量复水。

2 结果与讨论

2.1 不同保护剂对菌体细胞冷冻的保护作用

为了研究不同保护剂对醋酸菌的冷冻保护能力，我们研究了冷冻处理后不同保护剂的作用，结果如图1所示。对所得实验数据进行单因素方差分析，结果见表1、表2。

图1 不同保护剂对菌体细胞冷冻保护作用的比较Fig.1 Effect of different protectants on cell after freezing

表1 A.aceti冷冻保护剂的方差分析结果(n=3)Table 1 Variance analysis of the freezing protectants on A.aceti(n=3)

表1、表2的方差分析结果表明，不同保护剂对A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus的冷冻保护效果的影响显著性概率值均为P=0.000＜0.05，表明不同保护剂对A.aceti和 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷冻存活率的影响显著(P＜0.05)。采用Duncan新复极差法对两组数据进行的多重比较结果见表3。

表2 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷冻保护剂的方差分析结果(n=3)Table 2 Variance analysis of the freezing protectants on A.pasteurianus ssp.pasteurianus(n=3)

表3 冷冻保护剂的Ducan多重比较结果(n=3)Table 3 Multiple comparison of the freezing protectants(n=3)

从表3可看出，对于醋化醋杆菌菌株，可溶性淀粉和葡聚糖这2种保护剂的保护效果不佳，显著低于磷酸缓冲液对照，其他的所选保护剂均要显著高于对照的保护效果。海藻糖、玉米糊精和脱脂乳粉对醋化醋杆菌的冷冻保护作用最为突出，存活率均超过了50%，分别达到了73.58%、62.26%和60.38%，比缓冲溶液对照的24.53%提高了3倍左右。并且海藻糖、玉米糊精、脱脂乳粉之间也存在显著差异(P＜0.05)，保护效果:海藻糖＞玉米糊精＞脱脂乳粉。

对于巴氏醋杆菌巴氏亚种菌株，10种不同的保护剂中，除了甘露醇的保护效果与缓冲溶液对照无显著差异，其他9种保护剂的保护效果均显著高于缓冲溶液对照。葡聚糖、脱脂乳粉、玉米糊精和海藻糖的冷冻保护效果则较为显著，存活率分别达到了95.35%、89.53%、88.37%和52.32%，与缓冲溶液对照的2.33%相比分别提高了41倍、38倍、38倍和22倍。葡聚糖、脱脂乳粉、玉米糊精同海藻糖之间保护效果差异显著(P＜0.05)，保护效果:葡聚糖＞脱脂乳粉＞玉米糊精＞海藻糖。

从图1看出，小分子保护剂中海藻糖对两种菌株的冷冻保护作用最好，而高分子保护剂中脱脂乳粉和玉米糊精都对2种菌株均有较好的保护效果。冷冻过程对细胞膜的破环主要在于胞内外冰晶的形成和对细胞膜透性的影响。冰晶形成后，细胞质中盐浓度升高，造成胞内pH和离子强度改变，潜在的不利化学反应发生率提高［17］。研究表明，海藻糖具有稳定细胞膜和蛋白质结构、抗逆保护的作用［18］。在添加保护剂的情形下，冷冻过程中大量冰晶形成，体系中的可冷冻水含量降低，使保护剂的局部浓度大大提高，糖的玻璃化相转变温度从而提高，极易形成玻璃态，而处于玻璃态的体系往往更加稳定，不容易发生物理化学变化。在相同的条件下，海藻糖与其他糖类相比，显示了最高的玻璃化相转变温度［19］。从这个层面上讲，海藻糖更易形成玻璃态，这种玻璃态假说可能可以解释其对细胞的冷冻保护作用。而高分子保护剂中，脱脂奶粉和玉米糊精的保护效果较好，其主要是在细胞表面起到保护作用，通过“包埋”形式保护菌体。

相比较2种菌株，在未加保护剂的情况下，冷冻对于巴氏醋杆菌巴士亚种的伤害更大，缓冲溶液对照组中，其存活率仅有2.33%，而醋化醋杆菌的对照存活率达到了24.53%，近似高出了10倍。并且海藻糖(二糖)对醋化醋杆菌菌株效果最好，玉米糊精、脱脂乳粉(大分子)效果次之;巴氏醋杆菌巴士亚种菌株则相反，葡聚糖、脱脂乳粉、玉米糊精等大分子的保护效果最佳，而海藻糖的效果次之。推测造成这些保护剂效果的差异可能是由于不同属的菌株特性不同，培养过程中醋化醋杆菌的菌液比较黏稠，可能有较多的胞外多糖分泌，其本身的大分子物质对其菌株产生了一定的保护作用，这可能也是其未加保护剂能达到较高存活率的原因之一，因此小分子糖类对其的保护作用更显著;而巴氏醋杆菌巴士亚种分泌的多糖相对较少，所以大分子的包埋保护作用显得更明显一些。这些推测还要靠进一步的研究加以证实。

2.2 不同保护剂对菌体细胞冷冻干燥的保护作用

冷冻干燥对细胞造成损伤的主要原因在于:冰晶形成、盐浓度改变、细胞膜透性改变和代谢作用损伤。而保护剂在冷冻干燥过程中的保护作用，主要是其具有能与水结合、阻止胞内和胞外冰晶形成的能力。冷冻干燥处理后不同保护剂的作用结果如图2所示。

图2 不同保护剂对菌体细胞冷干保护作用的比较Fig.2 Effect of different protectants on cell after freeze-drying

对所得实验数据进行单因素方差分析，结果见表4、表5。

表4 A.aceti冷干保护剂的方差分析结果(n=3)Table 4 Variance analysis of the freeze-drying protectants on A.aceti(n=3)

表5 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷干保护剂的方差分析结果(n=3)Table 5 Variance analysis of the freeze-drying protectants on A.pasteurianus ssp.pasteurianus(n=3)

表4、表5的方差分析结果表明，不同保护剂对A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus的冷干保护效果的影响显著性概率值均为P=0.000＜0.05，表明不同保护剂对A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷干存活率的影响显著(P＜0.05)。采用Duncan新复极差法对两组数据进行的多重比较结果见表6。

从表6可以看出，对于醋化醋杆菌菌株，甘露醇、蔗糖、海藻糖同缓冲溶液对照的效果差异不显著，其他的7种保护剂存在显著差异。脱脂乳粉、乳糖、葡萄糖的保护效果较好，冻干存活率分别为92.86%、81.25%、46.88%，分别是对照的4.2倍、3.7倍和2.1倍。并且这三者之间也存在显著差异(P＜0.05)，保护效果:脱脂乳粉＞乳糖＞葡萄糖。

表6 冷干保护剂的Ducan多重比较结果(n=3)Table 6 Multiple comparison of the freeze-drying protectants(n=3)

对巴氏醋杆菌巴士亚种菌株，葡萄糖、乳糖、麦芽糖与对照样品比较差异不显著，其余7种保护剂有显著差异。脱脂乳粉和海藻糖的冷干保护效果较优，分别是对照的6倍和2.6倍，两者之间差异显著(P＜0.05)，冻干存活率:脱脂乳粉(72.92%)＞海藻糖(31.25%)。

从图2可以明显看出，脱脂乳粉对醋化醋杆菌和巴氏醋杆菌巴士亚种的冷冻干燥保护效果均是最好的。这是因为在干燥过程中，乳粉中的乳清蛋白能在菌体外形成蛋白衣保护层，对细胞加以保护，并且可以固定冻干的酶类，避免由于细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内物质泄漏，同时乳中的其他成分，如乳糖等，同样可以起到一定的抗逆保护作用。而海藻糖在冷干过程中的保护作用对巴氏醋杆菌巴士亚种比醋化醋杆菌显著，表明不是每种保护剂对所有菌株都有明显保护效果，由于细胞结构和大小都有所不同，对于不同菌株，即使采用相同的保护剂所取得的效果也有差异，所以需要实验来加以确定。

3 结论

(1)对菌体冷冻处理后，小分子保护剂中以海藻糖对两个菌株的保护效果最为显著，大分子保护剂中玉米糊精、脱脂乳粉以及葡聚糖呈现出较好的保护效果，这4种保护剂可优先用于对这2个菌种的冷冻保护剂的进一步优化研究。

(2)对菌体冷冻干燥处理后，脱脂乳粉对2个菌株的保护作用最好，其次乳糖、葡萄糖和海藻糖也起到一定的保护效果，这4种保护剂可用于下一步这2个菌株的冷干保护剂配方研究。

(3)每种保护剂对不同菌株的保护效果不同，由于细胞结构和大小都有所不同，即使采用相同的保护剂所取得的效果也有差异，所以每一种保护剂对每一醋酸菌菌株的存活率的影响都应该逐一确定。

(4)不同的保藏方法，每种保护剂起到的作用也不尽相同，要根据具体的工艺条件确定保护剂。

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