羊胎盘提取残余物免疫肽制备工艺的优化

周洁静，侯银臣，刘旺旺，李桂谊，杨公明

(华南农业大学 食品学院，广东广州，510640)

免疫活性肽是指一类存在于生物体内具有免疫功能的多肽。该类肽结构多样，是一种细胞信号传递物质，它通过内分泌、旁分泌、神经分泌等多种作用方式行使其生物学功能，沟通各类细胞间的相互联系。

近年来，有从各种微生物、动物、植物、乳源蛋白中采用酶解方法获得免疫活性肽的报道，如鸡蛋清［1-2］、牛乳酪蛋白［3］、鱼蛋白［4-5］、大豆蛋白［6-7］、小麦蛋白［8］、玉米胚芽蛋白［9］等。研究较多的免疫活性肽有抗菌肽、阿片肽、胸腺肽、酪蛋白磷酸肽、血管活性肠肽等［10］。酶制剂的种类及酶解条件对产物的成分、含量、活性起决定性作用。

胎盘含有免疫球蛋白、胶原蛋白、雌激素、肾上腺分泌的激素、干细胞生长因子、白细胞介素、转化生长因子等生物活性因子，具有抗氧化、免疫、修复组织损伤等功能作用。

我国是世界第一养羊大国，羊资源丰富，每年可以开发利用的羊胎盘潜藏量高达450万个，但是绝大多数都废弃扔掉，加工量不到3%，造成巨大的资源浪费，且污染了环境。本研究在提取羊胎盘活性物的基础上，以单独刺激指数作为评价指标，采用复合酶解技术利用羊胎盘提取残余物制备免疫活性肽，并在单因素优化基础上，应用响应面法优化制备工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊胎盘，山羊分娩的羊胎盘;风味蛋白酶(3.97×103U/g)，中性蛋白酶(4.69×103U/L)，购自诺维信中国销售代理广州明曜公司;ICR小鼠，5～6周龄小鼠，购自伟伦体校动物试验研究中心;RPMI(roswell park memorial institute)-1640基础培养液，购自上海立菲生物技术有限公司;D-Hank’s洗液，购自上海立菲生物技术有限公司;青霉素、链霉素混合液，购自上海立菲生物技术有限公司;小牛血清，购自上海立菲生物技术有限公司;MTT，购自美国Amresco公司;台盼兰粉末，购自美国Sigma-Aldrich贸易有限公司;ConA，购自美国Sigma-Aldrich贸易有限公司;其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

PHS-3D pH计，上海精密科学仪器有限公司;KDN-04A凯氏定氮仪，上海洪纪仪器设备有限公司;日立氨基酸分析仪，L-8800日本日立有限公司;85-2A恒温磁力搅拌器，常州博远实验分析仪器厂;SHA-CA数显水浴恒温振荡器，常州普天仪器制造有限公司;Anke TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂;SW-CJ-1F净化工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司;96孔细胞培养板，无锡耐思生物科技有限公司;2300-001L多模式微孔板检测仪，美国Perkin Elmer公司;CO2培养箱，美国Shellab公司;XSP-15C倒置生物显微镜，上海长方光学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料的预处理

(1)对分娩的羊胎盘立即收集并低温超速冻保藏，入-20℃冷库备用。(2)羊胎盘冷冻粉碎、液氮打浆。(3)pH 7.5的磷酸缓冲液在料液比1∶5、温度20℃的条件下搅拌提取2 h，在4 000 r/min，4℃条件下离心20 min，收集上清液，沉淀为羊胎盘下脚料作为制备免疫肽的酶解原料。

1.3.2 免疫肽制备工艺

羊胎盘原料→冷冻粉碎→液氮打浆→提取水溶性蛋白→离心收集羊胎盘提取残余物→复合酶解→灭酶→离心→酶解液

1.3.3 酶解工艺条件的单因素试验

1.3.3.1 不同酶添加量对小鼠脾细胞增值活性的影响

酶添加量设为 2 000，4 000，6 000，8 000，10 000 U/g蛋白，按中性蛋白酶与风味蛋白酶复配比1∶1，酶解时间3 h，酶解温度50℃，pH 7.0，料液比1∶50(g∶mL)进行酶解，测定酶解液的单独刺激指数。

1.3.3.2 不同复配比对小鼠脾细胞增值活性的影响

中性蛋白酶与风味蛋白酶复配比设为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，按酶添加量 4 000 U/g 蛋白，酶解时间3 h，酶解温度 50℃，pH 7.0，料液比 1∶50(g∶mL)进行酶解，测定酶解液的单独刺激指数。

1.3.3.3 不同酶解时间对小鼠脾细胞增值活性的影响

酶解时间设为 2，3，4，5，6 h，按酶添加量 4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶与风味蛋白酶复配比1∶1，酶解温度50℃，pH 7.0，料液比1∶50(g∶mL)进行酶解，测定酶解液的单独刺激指数。

1.3.3.4 不同酶解温度对小鼠脾细胞增值活性的影响

酶解温度设为 40，45，50，55，60℃，按酶添加量4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶与风味蛋白酶复配比1∶1，酶解时间3 h，pH 7.0，料液比 1∶50(g∶mL)进行酶解，测定酶解液的单独刺激指数。

1.3.3.5 pH值对小鼠脾细胞增值活性的影响

中性蛋白酶与风味蛋白酶的最适pH值均为7.0［11-12］，因此酶解pH选择2种酶的最适pH 7.0。

1.3.3.6 料液比对小鼠脾细胞增值活性的影响

料液比设为1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70 g 蛋白/ml，按酶添加量4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶与风味蛋白酶复配比1∶1，酶解时间3h，酶解温度50℃，pH 7.0，测定酶解液的单独刺激指数。

1.3.4 酶解工艺条件的响应面试验设计

在考察了酶添加量、复配比、酶解时间、酶解温度、料液比等单因素的基础上，通过Box-Behnken design(BBD)试验设计法，选定酶添加量、复配比、酶解时间3个因素作为目标变量，试验因素及水平如表1所示。

表1 试验因素与水平Table 1 Factors and Levels for the traial

1.3.5 小鼠脾细胞增值活性测定

参考MTT法，并对其进行一定改良后用于实验。无菌获取小鼠脾细胞，活细胞比例95% 以上，调整浓度至2×106个/mL;在96孔板中设空白组、对照组和样品组，3组分别为细胞溶液、细胞 +ConA溶液、细胞 +ConA+样品溶液。各组均设3个平行，置于含5%CO2，37℃中培养，终止培养前4 h加入10 μL无菌MTT溶液，继续孵育至结束;取出培养板，充分离心后，弃上清，加入150 μL DMSO溶液充分溶解结晶;于517 nm波长处采用酶标仪测其OD值。细胞增值活性以单独刺激指数(SI)表示。

1.3.6 水解度(DH)的测定［13-15］

采用茚三酮比色法。

1.4 数据处理

实验各值均为3个平行数据的均值，响应面试验数据采用Design Expert 8.0软件绘图并作方差和显著性分析等。

2 结果与分析

2.1 羊胎盘提取残余物的生化指标(表2)

表2 羊胎盘提取残余物Table 2 Composition of the precipitation

2.2 单因素试验的细胞增值活性

检测样品免疫活性时，阳性对照组SI值为0.044±0.002。

2.2.1 不同酶添加量对小鼠脾细胞增值活性的影响

由图1可知，羊胎盘酶解液对小鼠脾细胞增值活性，在2 000～8 000 U/g随着酶添加量的增加而增强。但当酶添加量超过8 000 U/g蛋白时，SI值却下降。

图1 不同酶添加量对SI值的影响Fig.1 Effect of enzyme addition on stimulation index

这可能是由于酶添加量小于8 000 U/g蛋白时，底物与酶的浓度比仍未饱和，增加酶添加量，可加快酶解进程，产生更多的羊胎盘免疫活性肽。而当酶添加量继续增大到10 000 U/g蛋白时，底物浓度相对较低，酶分子过于饱和，所以水解程度变化不大，免疫活性肽的量不再增加。相反，过量的酶会把具有免疫活性的肽进一步水解为更小分子质量肽或氨基酸，导致最终产物的目标免疫活性SI值下降。可知，复合酶加入最佳值为8 000 U/g蛋白。

2.2.2 不同复配比对小鼠脾细胞增值活性的影响

由图2显示，随着中性蛋白酶与风味蛋白酶复配比的增大，其SI值先缓慢下降，当复配比为1∶1时，SI值最少为0.045。继续增大复配比，SI值快速上升。当复配比为2∶1时，SI值最大达0.170。复配比与酶解液的SI值并没明显的相关关系，这可能与蛋白酶的酶切位点有关。

图2 不同复配比对SI值的影响Fig.2 Effect of complex interactions on stimulation index

2.2.3 不同酶解时间对小鼠脾细胞增值活性的影响

由图3可知，随着酶解时间的延长，酶解产物的SI值先增大后减少，当酶解时间为5 h时，产物的SI值达最高值为0.181。酶解时间控制5 h内，酶解产物中蛋白质逐渐被分裂成肽，反应体系中存在大分子蛋白，具有免疫活性的肽和氨基酸，这些成分在复合蛋白酶的作用下发生变化，这个过程比较复杂，存在多种转化方式，但是酶解时间过长，SI值下降，可能由于随着酶解的进行，复合蛋白酶切断了具有高免疫活性的肽链，导致产物的SI值下降。因此需要合理控制酶解反应的时间。

图3 不同酶解时间对SI值的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on stimulation index

2.2.4 不同酶解温度对小鼠脾细胞增值活性的影响

由图4可知，酶解温度为45℃时，酶解产物具有较高的SI值。这与中性蛋白酶和风味蛋白酶的最适温度有关。中性蛋白酶和风味蛋白酶的最适温度分别为45℃和55℃［11-12］，而在此温度下，产物的 SI值较高，45℃时，SI值最高。可能中性蛋白酶更有利于羊胎盘免疫活性肽的生成，因此在中性蛋白酶最适酶解温度下，产物的活性最高。同时，考察复配比对小鼠脾细胞增值活性的影响时，当中两者的复配比为2∶1或3∶1时，产物的 SI值均高于复配比为 1∶3或1∶2，进一步也说明中性蛋白酶更有利于羊胎盘免疫活性肽的制备。

图4 不同酶解温度对SI值的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on stimulation index

2.2.5 不同料液比对小鼠脾细胞增值活性的影响

由图5 可知，料液比在 1∶30 ～1∶50(g∶mL)时，SI值总体呈上升;单料液比大于1∶50(g∶mL)时，SI值开始下降。可能随着料液比的增加，底物逐渐由浓稠状变稀释，有利于蛋白酶与底物充分接触，提高酶解效率，产生更多具有免疫活性的肽，但是随着料液比越来越大，底物过于稀释，大量的水反而增加了蛋白酶与底物的接触难度，导致体系酶解不完全，蛋白质难以被分解成具有免疫活性的肽。何佳易［16］等研究表明酶解程度与底物质量浓度有关，为本实验数据提供理论依据。

图5 不同料液比对SI值的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on stimulation index

2.3 响应面法优化羊胎盘免疫活性肽的工艺

2.3.1 响应面试验结果

响应面试验设计及响应值见表3，利用Design Expert8.0对表3中的试验数据进行多元回归拟合及对模型进行方差分析，分析结果如表4所示。

表3 响应面设计方案以及响应值Table 3 Experiment design and result of response surface method analysis

表4 响应面方差分析表Table 4 Variance analysis of regression equation

续表4

各因素经二次多项回归拟合后，得到单独刺激指数SI对酶添加量、复配比和酶解时间的二次多项回归方程:单独刺激指数=-0.16+3.04A+0.071B+0.18C-1.03AB+8.31AC+7.66BC-1.07A2-0.022B2-0.028C2。该模型的P＜0.000 1，表明模型方程极显著，不同处理间的差异极显著;失拟项P=0.329 2＞0.05，差异不显著，说明残差由随机误差引起;模型的校正决定系数R2Adj=0.950 7，即该模型能解释95.07%的响应值变化;复相关系数为 R=0.950 7，说明该模型拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型分析和预测羊胎盘免疫肽。

由显著性检验可知，模型的单项A，二次项A2、B2、C2，交互项AC极显著;单项 C，交互项 AB显著;单项B，交互项BC不显著。各因素对单独刺激指数影响的大小依次为酶添加量(A)、酶解时间(C)、复配比(B)。

2.3.2 响应面试验交互因素分析

从所得响应面分析图中可以看出响应值与各影响因素的关系，分析出各因素之间的相互作用，如图6～图8所示。

由图6～图8响应面和等高线图分析可知，复配比和酶解时间交互作用对单独刺激指数的影响最显著，其次酶添加量和复配比交互作用对单独刺激指数的影响显著。相比较而言，复配比和酶解时间的交互作用稍弱。

图6 酶添加量和复配比交互作用对单独刺激指数影响的响应面图和等高线Fig.6 Response surface and contour plot of stimulation index of enzyme addition and complex interactions

2.3.3 模型验证试验

从上述回归方程可知，制备羊胎盘免疫肽最优工艺条件为:酶添加量2 007.65 U/g，复配比1.75∶1，酶解时间3.7 h。考虑到实际操作将其工艺条件优化为:酶添加量2 500 U/g，复配比1.75∶1，酶解时间4 h。在此条件下进行3次验证试验，酶解液的水解度平均值为39.60%，单独刺激指数平均值为0.261 2，理论值与实际值的误差不超过1.21%，结果表明，该模型可以较好地反映出羊胎盘免疫肽的最佳制备条件。

图7 酶添加量和酶解时间交互作用对单独刺激指数影响的响应面图和等高线Fig.7 Response surface and contour plot of stimulation index of enzyme addition and time

图8 复配比和酶解时间交互作用对单独刺激指数影响的响应面图和等高线Fig.8 Response surface and contour plot of stimulation index of complex interactions and time

3 结论

通过酶解法制备羊胎盘免疫肽，在单因素试验基础上，运用响应面法对制备羊胎盘免疫肽的酶添加量、复配比和酶解时间进行优化，得到酶解制备羊胎盘免疫肽的最佳工艺条件为:酶添加量2 500 U/g蛋白，复配比1.75∶1，酶解时间4 h。在此条件下，酶解液的水解度平均值为39.60%，单独刺激指数平均值为0.261 2，较阳性对照增加494%。结果表明通过优化提高羊胎盘酶解产物的免疫活性。

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