温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中非挥发性物质的影响

郑晓杰，林胜利，聂小华，许丹

1(温州科技职业学院(浙江温州市农业科学研究院)，浙江温州，325006)

2(浙江工业大学海洋学院，浙江 杭州，310014)

鸡骨是肉鸡加工过程中产生的大宗副产品，约含12%的蛋白质;其酶解液常用作食品调味料基料，广泛应用于方便食品、膨化食品与肉制品等生产中。但由于鸡骨酶解液风味不足，使用前需要进行风味调制，而美拉德反应是蛋白酶解物增香的有效手段。安广杰等［1］将鸡骨架酶解液添加一定的辅料后进行美拉德反应制得优良的鸡肉香精;孙红梅等［2］应用模糊数学感官评价方法优化得到鸡骨素美拉德反应的工艺参数。已有研究表明，美拉德反应产物肉味强度比传统的煮鸡或烤鸡的肉味强80～100倍［3］。

目前鸡骨资源的研究多集中于酶解工艺［4-5］、酶解液美拉德反应工艺［1-2］及挥发性物质分析［6］等方面，而鸡骨酶解液美拉德反应产物中非挥发性物质的相关研究很少。本文以鸡骨酶解液为原料，在不同温度下进行鸡骨酶解液与木糖之间的美拉德反应，研究其反应产物中游离氨基酸、肽类等非挥发性物质的变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻鸡骨架，市售，去除表层肌肉与脂肪;木瓜蛋白酶(60万U/g)、胰酶(1400U/g)、中性蛋白酶(4.7万U/g)，购于河南华森食品配料有限公司。

SpectraMax M2多功能酶标仪，美国MD公司;紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;CR22N/CR21N高速冷冻离心机，日本日立公司;SYKAM S-433D全自动氨基酸分析仪，德国SYKAM公司;Waters 600高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡骨酶解液的制备

称取一定量的鸡骨，加入1∶1.5(g∶mL)水后于130℃高压蒸煮20 min，匀浆后于50℃和自然pH下进行复合酶酶解，其中复合酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶(1∶2∶1)，添加量为1 g原料添加2 200 u;酶解3.5 h后于100℃下处理15 min，冷却，离心去沉淀，上清液即为鸡骨酶解液。

1.2.2 鸡骨酶解液的美拉德反应

取鸡骨酶解液50 mL，加入木糖2.0 g，分别于不同温度下反应90 min，即为鸡骨酶解液的美拉德反应产物。

1.2.3 pH的测定

采用数字酸度计直接测定美拉德反应产物中pH值。

1.2.4 褐变程度的测定

将美拉德反应产物稀释25倍后，于420 nm处测定吸光值。

1.2.5 自由氨基的测定

采用邻苯二甲醛法(oPA法)［7］。将美拉德反应产物稀释100倍后，取0.1 mL稀释液加入3 mL 0.05 mol/L硼砂缓冲溶液(含0.8 mg/mL OPA，1%SDS，2 μg/mL β-巯基乙醇)，混匀，室温下反应 3 min，于340 nm下测定吸光度。以赖氨酸绘制标准曲线，吸光值转换为赖氨酸浓度当量。

1.2.6 游离氨基酸的分析

取10 mL美拉德反应产物，加入等体积10%三氯乙酸，过滤沉淀，取滤液，采用SYKAM S-433D全自动氨基酸分析仪进行分析。

1.2.7 肽分子量分布的分析

将美拉德反应产物稀释5倍后，微孔滤膜过滤。采用Waters 600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Empower工作站GPC软件)测定。色谱柱:TSK-gel 2000 SWXL 300 mm ×7.8 mm;柱温:30℃;流动相:乙腈/水/三氟乙酸(45∶55∶0.1，体积比);流速:0.5 mL/min;检测波长:220 nm。分子量校正曲线所用标准品为细胞色素C、杆菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸。

1.2.8 数据分析

实验数据采用SPSS18.0软件中Duncan法进行各组之间的显著性分析(P＜0.05)，采用Origin8.0对数据进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中pH值和褐变程度的影响

已有研究表明，美拉德反应过程中可消耗游离氨基基团和产生甲酸、乙酸等酸性物质，从而导致反应体系pH值下降［8］，因此pH值是衡量美拉德反应程度的重要参数。图1表明，鸡骨酶解液经美拉德反应后，其pH值显著下降，由起始的6.09降至4.77～4.45，但各美拉德反应产物之间不存在显著性差异。这可能是因为起始pH值为弱酸性，美拉德反应程度缓慢，无法体现出不同温度下鸡骨酶解液美拉德反应产物pH之间的差异。

褐变程度是检测美拉德反应进展的另一个重要指标，常用420 nm处吸光度来表示，A420nm值增加表明美拉德反应最后阶段褐色素的产生。由图1可知，鸡骨酶解液美拉德反应产物中A420nm值随着反应温度的增加而快速增加，与反应温度之间呈现显著的正相关性;当反应温度为100℃时，A420nm值比对照组增加了7倍以上。Lan等亦认为温度很大程度上影响着大豆肽-木糖美拉德反应体系的褐变程度［9］。

图1 温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中pH值和褐变程度的影响Fig.1 Effect of temperature on pH and browning in Maillard reaction products

2.2 温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中自由氨基的影响

美拉德反应中蛋白质、肽类或氨基酸的α-或ε-氨基与还原糖类发生共价结合，消耗的自由氨基越多，反应越彻底。由图2可知，鸡骨酶解液美拉德反应产物中自由氨基含量发生显著降低，其含量损失随着反应温度增加而增加;温度高于90℃，鸡骨酶解液美拉德反应比较彻底，自由氨基由起始的388.23 mmol/L降至 300～310 mmol/L，损失率分别为20.22%(90℃)和21.79%(100 ℃)。JIANG 等［7］研究酪蛋白-半乳糖美拉德反应时亦发现，在pH5～6、95℃下反应2 h，自由氨基损失率较低，约为15%～20%;只有当pH＞9.0时自由氨基才被大量消耗，这主要因为碱性、高温的环境更有利于美拉德反应进行。此外，鸡骨酶解液美拉德反应产物中自由氨基含量的降低与反应温度、褐变程度的增加均存在正相关性，刘蒙蒙［10］、ZENG［11］等亦报道了相似结论。

图2 温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中自由氨基的影响Fig.1 Effect of temperature on amino groups in Maillard reaction products

2.3 温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中游离氨基酸的影响

游离氨基酸是美拉德反应的重要底物，其参与美拉德反应的活性各有不同。由表1可知，鸡骨酶解液中共检出15种游离氨基酸，总量为14 404.2 mg/L。经美拉德反应后游离氨基酸总量显著降低至7 271.2～7 756.7 mg/L，这主要源于氨基酸和糖类之间的交联反应，其中损失变化较大的游离氨基酸依次是丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和亮氨酸，这说明上述4种游离氨基酸具有较强的美拉德反应活性，且总体上其损失率与反应温度呈现正相关性，经100℃反应90 min后分别降低了97.57%、67.60%、57.08%和50.95%。而天冬氨酸和甘氨酸含量随着反应温度的增加而增加，尤其是在100℃反应体系中分别增加了51.37%和19.19%，这可能是因为在弱酸、高温下肽降解作用生成的游离氨基酸大于美拉德反应消耗的游离氨基酸;LAN等［9］认为，还原糖的存在改变了肽的结构，有助于肽在高温下降解生成氨基酸。此外，鸡骨酶解液-木糖美拉德反应中半胱氨酸、缬氨酸、组氨酸和赖氨酸等含量变化不大。但赵谋明等研究发现，鸡肉蛋白肽-葡萄糖美拉德反应体系中精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸降解率最高［12］。

表1 温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中游离氨基酸的影响 单位:mg/LTable 1 Effect of temperature on free amino acids in Maillard reaction products

2.4 温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中肽分子量分布的影响

蛋白酶解液中存在着不同分子量肽段，不仅发生热降解产生美拉德反应的中间产物，而且直接参与美拉德反应［13］。由表2可知，鸡骨酶解液-木糖美拉德反应产物中分子量＞500 Da的5个组分含量均发生显著下降，同时伴随着分子量＜500 Da的组分含量明显增加。据此推测弱酸条件下美拉德反应体系中肽段的热降解作用远大于交联作用;赵谋明、刘平等亦报道了不同分子量肽段在美拉德反应过程中存在着热降解情况［12，14］。对不同温度的美拉德反应产物进行比较，随着反应温度增加，分子量＞5000 Da的组分略有增加，3000～5000 Da和2000～3000 Da的组分表现出先降后增加，1000～2000 Da和500～1000 Da组分含量逐步降低，分子量＜500 Da的组分则呈现逐步增加，这说明温度越高肽段更易发生美拉德反应，鸡骨酶解液中各肽段与木糖发生美拉德反应的能力不同，其中1000～2000 Da和500～1000 Da组分具有较高的美拉德反应活性，该肽段可能含有较高反应活性的末端氨基酸。

表2 温度对鸡骨酶解液-木糖美拉德反应体系中肽分子量分布的影响Table 2 Effect of temperature on peptides in Maillard reaction products

3 结论

随着反应温度的增加，鸡骨酶解液-木糖美拉德反应程度增加，pH明显降低，褐变程度的增加、自由氨基含量的减少均与温度呈现正相关性;经美拉德反应后大部分游离氨基酸和肽段等含量显著下降，其中丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和亮氨酸等氨基酸和1 000～2 000 Da和500～1 000 Da组分具有较高的美拉德反应活性。

［1］ 安广杰，袁京，李学红.美拉德反应法制备鸡肉味香精［J］.中国调味品，2010，35(10):77-80.

［2］ 孙红梅，王金枝，张春晖，等.应用模糊数学优化鸡骨素美拉德反应工艺［J］.中国食品学报，2014，14(6):74-80.

［3］ Lieake B.Protein hydrolysis:the key to meat flavoring systems［J］.Food Reviews Imemational，1994，10(3):287-312.

［4］ 李苗云，赵改名，许雄，等.鸡骨渣中蛋白质的酶解应用效果研究［J］.食品科学，2013，34(9):185-188.

［5］ 张恒，邬应龙.鸡骨的酶解及酶解液的电泳分析［J］.食品与发酵工业，2010，37(9):102-105.

［6］ 孙红梅，李侠，张春晖，等.鸡骨素及其酶解液的美拉德反应产物挥发性风味成分比较分析［J］.分析测试学报，2013，32(6):661-667.

［7］ JIANG Z，WANG L，CHE H，et al.Effects of temperature and pH on angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity and physicochemical properties of bovine casein peptide in aqueous Maillard reaction system［J］.LWT-Food Science and Technology，2014，59(1):35-42.

［8］ Brands CMJ，Van Boekel MAJS.Kinetics modeling of reactions in heated monosaccharide-casein system［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(23):6 725-6 739.

［9］ LAN X，LIU P，XIA S，et al.Temperature effect on the nonvolatile compounds of Maillard reaction products derived from xylose-soybean peptide system:Further insights into thermal degradation and cross-linking［J］.Food Chemistry，2010，120(4):967-969.

［10］ 刘蒙蒙，杨美智子，孙云，等.罗非鱼鱼皮胶原肽-葡萄糖美拉德反应产物的制备及其抗氧化活性［J］.食品与发酵工业，2014，40(3):158-16.

［11］ ZENG Y，ZHANG XX，GUAN YP，et al.Characteristics and antioxidant activity of Maillard reaction products from psicose-lysine and fructose-lysine model systems［J］.Journal of Food Science，2011，76(3):398-403.

［12］ 赵谋明，晓房，崔春，等.鸡肉蛋白肽-葡萄糖Maillard反应中肽的降解研究［J］.四川大学学报·工程科学版，2007，39(2):77-81.

［13］ Oh YC，Shu CK，Ho CT.Some volatile compounds formed from thermal interaction of glucose with glycine，diglycine，triglycine and tetraglycine［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1991，39(9):1 553-1 554.

［14］ 刘平，张晓鸣.大豆肽-木糖美拉德反应体系中肽的降解与交联规律研究［J］.食品工业科技，2011，32(4):91-96.