无梗五加果中抗氧化物质的提取

冯颖，赵琳娜

(沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110866)

无梗五加(Acanthopanax sessiliflorum)又名五加皮、刺拐棒等，为五加科Araliaceae五加属多年生药膳两用植物［1］，通常山地野生，分布在东北、河北、朝鲜等地［2－3］。

近年来，多种研究表明，人体疑难疾病的发生机理与体内自由基产生过多或机体清除自由基能力下降有着极为密切的关系［4］，因此，从植物中提取天然的抗氧化物质和开发具有抗氧化功能的食品越来越受到广泛的关注和重视。

无梗五加果富含黄酮、多糖、花色苷等多种抗氧化物质［5－6］，作为抗氧化食品开发具有巨大的潜力。目前关于其抗氧化物质的提取研究报道主要是针对其中的某一类成分，对其总抗氧化物质提取的系统研究报道较少［7－8］，本研究以丹东农业科学院提供的无梗五加果作为原料，在单因素试验的基础上，采用响应面法分析，以无梗五加果提取液总抗氧化能力为响应值，对其总抗氧化物质的提取工艺进行优化，获得最优工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

无梗五加果:人工栽培品种，由辽宁省丹东农业科学院提供。

无水乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司;T-AOC试剂盒，南京建成生物科技有限公司。

7200型可见分光光度计，尤尼克(上海)有限公司;电子天平，上海精密科学仪器厂;UV-1600型紫外可见光分光光度计，北京瑞利分析仪器公司;超声波反应器(KQ-250A型)，昆山市超声仪器有限公司;电热恒温水浴锅，常州国华电器有限公司;TDL-5000B型离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 无梗五加果中抗氧化物质的提取工艺

无梗五加干燥果实→粉粹过40目筛→超声提取→离心→定容至100 mL→总抗氧化能力测定

1.2.2 单因素试验

以无梗五加干燥果为原料，以样品的总抗氧化能力为考察对象，分别以提取剂、料液比、提取温度、提取时间、超声功率5个因素进行单因素试验，考察各因素对提取液总抗氧化能力的影响。

1.2.2.1 提取剂的选择

料液比1∶50(g∶mL)，提取温度 50℃，提取时间30 min，功率为250 W条件下考察提取剂为蒸馏水以及乙醇体积分数分别为10%、30%、50%、70%时对提取液总抗氧化能力的影响。

1.2.2.2 料液比的选择

蒸馏水为提取溶剂，提取温度50℃，提取时间30 min，超声功率250 W条件下考察料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 时对提取液总抗氧化能力的影响。

1.2.2.3 提取温度的筛选

蒸馏水为提取溶剂，料液比为1∶60，提取时间30 min，超声功率250 W条件下考察提取温度分别为 30、40、50、60、70℃ 时对提取液总抗氧化能力的影响。

1.2.2.4 提取时间的筛选

蒸馏水为提取溶剂，料液比为1∶60、提取温度60℃，超声功率250 W条件下考察提取时间分别为15、30、45、60、75 min 时对提取液总抗氧化能力的影响。

1.2.2.5 超声功率的筛选

蒸馏水为提取溶剂，料液比为1∶60、提取温度60℃，提取时间为30 min条件下考察超声功率分别为 150、175、200、225、250 W 时对提取液总抗氧化能力的影响。

1.2.3 响应面试验设计

根据单因素试验所得的结果，以无梗五加果提取液总抗氧化能力为响应值，对超声波提取无梗五加果中抗氧化物质影响较大的3个因素提取温度、提取时间、超声功率进行三因素三水平的试验设计。利用Design Expert8.0软件进行工艺参数的优化组合，采用Box-Behnken响应面分析得到回归模型和优化的工艺参数。

1.2.4 总抗氧化能力(TAC)测定

分别取等浓度和等体积的各样品液，按TAC测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书测定各样品液TAC。定义为在37℃时，每min每mL各样品液使反应体系的吸光度(OD)值增加0.01为1个TAC单位(u)，即表示为u/mL。取样及测定均重复3次，取平均值记录结果。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取剂对提取液的总抗氧化能力的影响

提取剂对提取液总抗氧化能力的影响见图1。

图1 提取剂对提取液总抗氧化能力的影响Fig.1 Effect of extractant on total antioxidant capacity

从图1可以看出，随着乙醇浓度的提高，提取液总抗氧化能力逐渐下降，蒸馏水提取所得提取液抗氧化能力最强，说明无梗五加果中的大部分抗氧化物质具有水溶性，故以水作为无梗五加果中抗氧化物质的提取剂进行后续实验。

2.1.2 料液比对提取液的总抗氧化能力的影响

料液比对提取液总抗氧化能力的影响结果如图2所示。

图2 料液比对提取液总抗氧化能力的影响Fig.2 Effect of material/liquid ratio on total antioxidant capacity

从图2可以看出，随着提取剂用量的增加，所得提取液的总抗氧化能力也在逐渐增加，当料液比为1∶60(g∶mL)时，总抗氧化能力达到最大，料液比继续增大，提取液抗氧化能力略有下降。

2.1.3 提取温度对提取液的总抗氧化能力的影响

提取温度对提取液总抗氧化能力的影响结果如图3所示。

图3 提取温度对提取液总抗氧化能力的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on total antioxidant capacity

从图3可以看出，提取液总抗氧化能力随着提取温度的升高而逐渐增加，当提取温度达到60℃时，总抗氧化能力达到最高值，温度继续增加，总抗氧化能力变化不明显。

2.1.4 提取时间对提取液总抗氧化能力的影响

提取时间对提取液总抗氧化能力的影响结果如图4所示。

图4 提取时间对提取液总抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of extraction time on total antioxidant capacity

从图4可以看出，随着提取时间的增加，提取液总抗氧化能力增加，在30 min时达到最大值，提取时间继续增加，抗氧化物质在超声波的作用下被破坏分解，提取液总抗氧化能力反而逐渐下降，所以选择提取时间30 min最佳。

2.1.5 超声功率对提取液的总抗氧化能力的影响

提取功率对提取液总抗氧化能力的影响结果如图5所示。

图5 超声功率对提取液总抗氧化能力的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on total antioxidant capacity

从图5可以看出，随着超声波功率的提高，总抗氧化能力随之逐渐增加，当功率为225 W时提取液总抗氧化能力出现峰值，功率继续提高，总抗氧化能力下降。原因可能是功率加大导致提取物中活性成分分解以至于抗氧化能力下降，所以提取功率选择225 W最佳。

2.2 响应面试验设计优化工艺参数

2.2.1 试验因素和水平的选择

综合上述单因素试验结果，以无梗五加果提取液总抗氧化能力为响应值，选取对超声波提取无梗五加果中抗氧化物质影响较大的三个因素提取温度、提取时间、超声功率进行三因素三水平的试验设计。试验因素和水平见表1。

2.2.2 响应面分析设计及结果

根据Design Expert8.0软件对实验进行安排，试验结果分析见表2、表3。

表1 实验因素水平及编码Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Program and experimental results of RSA

表3 总抗氧化能力回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation for the yield of total antioxidant capacity

对响应值以及各因素进行拟合，得到关于总抗氧化能力的回归方程如下:

变量模型P＜0.01，达到极显著水平，回归方程失拟检验P＞0.05，差异不显著，说明所得的回归方程拟合程度良好。表3方差分析结果表明方程的一次项提取时间(X2)对响应值总抗氧化能力的影响极显著，超声功率(X3)对响应值的影响显著;交互项X2X3对响应值的影响极显著，X1X2对响应值的影响显著;二次项X12、X22、X32对响应值的影响极显著，由此可知，各具体试验因素对响应值的影响并非是简单的线性关系。

2.2.3 响应面曲面直观分析

图6 提取温度和提取时间交互作用对总抗氧化能力的影响Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and time on total antioxidant capacity

图7 提取时间和超声功率交互作用对总抗氧化能力的影响Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of time and power on total antioxidant capacity

从图6可以看出，提取温度对提取液总抗氧化能力的影响变化趋势受提取时间的交互作用的影响。当提取时间较大时，提取液总抗氧化能力偏低且随着提取温度的升高先增加后下降的趋势更加明显。

从图7可以看出，提取时间对提取液总抗氧化能力的影响变化趋势受超声功率的交互作用的影响。在所考察的功率范围内，当超声功率较大时，总抗氧化能力随提取时间的增加先逐渐增大后减小，当超声功率较小时，总抗氧化能力随提取时间的增加而逐渐下降。

从图8可以看出，提取温度对提取液总抗氧化能力的影响变化趋势不受超声功率的交互作用的影响。在所考察功率范围内，提取液总抗氧化能力均呈现先增加后下降的相同趋势。

2.2.4 响应面试验模型的验证

通过回归方程可以得到最优的预测值，即提取温度60.84℃，提取时间27.65 min，超声功率226.88 W，此时总抗氧化能力的理论值可达88.440 9 u/mL。结合实际操作，优化工艺参数，即提取温度61℃，提取时间28 min，超声功率227 W。并对最佳条件做了3次重复试验进行验证，平均总抗氧化能力为(88.257 2±0.342 3)u/mL，所得参数较为可靠。

图8 提取温度和超声功率交互作用对总抗氧化能力的影响Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and power on total antioxidant capacity

3 结论

(1)在单因素试验的基础上，采用响应面分析法优化了各参数，并结合实际操作选择了无梗五加果抗氧化活性物质提取的最优工艺条件:提取温度61℃，提取时间28 min，超声功率227 W。并对最佳条件做了3次重复试验进行验证，平均总抗氧化能力为(88.257 2±0.342 3)u/mL，说明响应面试验设计分析能较准确地对提取抗氧化物质的工艺参数进行优化。

(2)由试验数据表明，对总抗氧化能力影响最大的因素是提取时间，其次是超声功率，影响最小的是提取温度。提取时间和超声功率交互作用对总抗氧化物质的提取效果影响极显著，提取温度和提取时间交互作用对总抗氧化物质的提取效果影响显著。

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