冻藏温度对鱿鱼品质的影响*

路钰希，林玉海，李学英，杨宪时，黄洪亮

1(中国水产科学研究院东海水产研究所，上海，200090)2(上海荷美尔食品有限公司，上海，201900)

鱿鱼因具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等营养特点，深受广大消费者的喜爱，已成为北太平洋海域重要的经济头足类水产。鱿鱼的胴体部分约占体重的50%，头足部分约占体重的30%，故鱿鱼可食部分达80%以上，比一般鱼类高出20%左右，是良好的水产品加工原料［1］。日本从1970年开始利用该资源，中国则从1994年起开发利用，现已成为中国重要的远洋渔业捕捞对象［2］。

国内、外已有对鱿鱼加工贮藏中品质变化的研究，吴燕燕［3］等利用无磷品质改良剂研究了其在阿根廷鱿鱼变性过程中对品质的影响，其中，观察了改良剂对鱿鱼浸泡增重率、自由液滴损失率、蒸煮损失率、盐溶性蛋白、肌原纤维蛋白钙ATP酶(Ca2+-ATP酶)活性、pH、总挥发性盐基氮(TVB-N)以及色泽变化的影响;金淼等［4］通过对鱿鱼肌原纤维蛋白含量、总巯基和活性巯基含量、Ca2+-ATPase活性、质构特性变化的研究，确定了引起秘鲁冷冻鱿鱼蛋白变性的主要生产环节;Paulo Vaz-Pires等［5］对在冰点贮藏下的鱿鱼感官、微生物及物理化学变化进行了研究。目前国内、外有关冻藏温度对鱿鱼品质变化影响的研究还鲜有报道。

近年来，国际上对于水产品储藏温度的要求趋于低温化，英国对所有冻结鱼虾类制品推荐-30℃贮藏;美国认为水产品的冻藏温度应在-29℃以下;我国对水产品储藏的温度没有严格的要求，一般在-20℃左右，这对虾类、贝类、鳗鱼、金枪鱼等含脂肪较多的水产品缺乏科学依据，同时，风险较大，因此，探讨最佳储藏温度对保存具有较高商业价值的水产品具有很大现实意义。本实验以北太平洋鱿鱼为研究对象，选择不同的贮藏温度(-10、-20、-30和-40℃)，通过分析鱿鱼持水力(water holding capacity，WHC)、pH、硫代巴比妥酸反应物(tiobarbituric acid reactive substances，TBARS)、甲 醛 (formaldehyde，FA)、盐溶性蛋白含量(salt soluble protein，SSP)、活性巯基含量和Ca2+-ATPase活性的变化，探讨冻藏温度对鱿鱼品质变化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱿鱼样品:捕捞船于2012年10月在赤道公海区域捕捞，品种为秘鲁鱿鱼，船上冻结后-20℃贮藏运输至实验室，-80℃贮藏备用。

JYL-350型绞肉机，上海九阳股份有限公司;MPR-414F型冰箱，Sanyo，日本;SIM-F140AY65制冰机Sanyo，日本;IUL型均质机，西班牙;5810R型高速冷冻离心机，Eppendorf，德国;TMS-Pro型质构仪，Food Technology Corporation，美国;721型可见光分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司;PHS-2C酸度计，上海伟业有限公司;YP200N型电子天平，上海菁海仪器有限公司;DK-524型水浴锅，上海晋理科学仪器有限公司;500mL蒸馏烧瓶装置，上海长城华美仪器化剂有限公司。

1.2 样品处理方法和贮藏试验

鱿鱼流水解冻，去头、皮和内脏，胴体切小块装袋密封，分别贮藏于［(-10、-20、-30、-40)±0.1］℃冰箱中，分别每隔 10、15、20、30d 取样，4 种贮藏温度条件分别取样7个时间点，测定鱿鱼持水力、pH、TBARS、FA、盐溶性蛋白含量、活性巯基含量和Ca2+-ATPase含量。

1.3 实验方法

1.3.1 持水力的测定

利用TMS-Pro型质构仪，采用滤纸加压法(filter paper press method)进行测定。取完整肉块10.0g置于10层滤纸上，另取10片滤纸置于其上，定压100N压5min，加压前后分别称重，记录加压前质量(m1)和加压后质量(m2)，则加压条件下的持水力可以用加压失水率Xp(pressing loss)表示:

式中:Xp，加压失水率，%;m1，加压前鱿鱼质量，g;m2，加压后鱿鱼质量，g。

1.3.2 pH值的测定

称取10.0 g绞碎的样品，置于100 mL有盖的三角烧瓶中加入90 mL无菌蒸馏水，浸泡30 min并不时振摇。过滤后取滤液，用便携式pH测定仪测定，每个样品至少做2个平行。

1.3.3 TBARS的测定

［6］，与 TBARS反应的物质的量(TBARS)单位表示为mg·MA/kg，试验重复2次。

1.3.4 FA的测定

用乙酰丙酮法，参照SC/T 3025-2006，水产品中甲醛的测定。将样品绞碎，称取10.0 g于500 mL蒸馏瓶中，加入液体石蜡2.5 mL和10%磷酸溶液10 mL，再加蒸馏水至200 mL。连接冷凝装置，冷凝管下口插入盛有20 mL蒸馏水且置于冰浴的100 mL烧杯中，立即加热蒸馏，收集蒸馏液80～90 mL，冷却，移入100 mL容量瓶中，定容，同时做空白蒸馏。分别移取样品蒸馏液5 mL于10 mL比色管中，加水至10 mL，再加入乙酰丙酮溶液1 mL，混合均匀，置于沸水浴中10 min，取出，冷却，以空白为参比，于波长415 nm处，以1 cm比色杯进行比色，测定吸光度。每个样品至少2个平行。

1.3.5 SSP的测定

鱿鱼用搅拌机绞碎，取5 g装入打浆袋中，加入100 mL冷却的0.6 mol/L KCl溶液，然后放入均质机内匀浆2次，4℃条件下提取1.5 h，在4℃条件下以11 000 r/min离心10 min，取上清液作为实验用盐溶性蛋白溶液。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量［7］，用牛血清蛋白做标准曲线，标准曲线为 y=0.005 5x+0.003 6(R2=0.999 3)，计算结果以mg/g表示，试验重复3次。

1.3.6 肌动球蛋白的提取

鱿鱼绞碎后取5 g，加入50 mL冷却的0.6 mol/L KCl(4℃)，匀浆1次，放入4℃冰箱中提取1.5 h，然后离心(5 000 r/min，30 min，0℃)，取 10 mL 上清夜加入30 mL冰冷的去离子水稀释沉淀肌动球蛋白，离心(5 000 r/min，20 min，0℃)，所得沉淀加入 30 mL冰冷的1.2 mol/L KCl溶液，在0℃搅拌30 min，不溶部分再次离心(5 000 r/min，20 min，0℃)［8］。所得肌动球蛋白溶液用0.6 mol/L KCl调节浓度在4～6 mg/mL。所得溶液备用，以测定活性巯基和Ca2+-ATPase的含量。

1.3.7 活性巯基含量的测定

向1 mL肌动球蛋白中加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)，混合均匀后取4 mL混合溶液，加入0.4 mL 0.1%5，5’二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液，在40℃下反应25 min，溶液在412 nm下测定吸光值。空白用0.6 mol/L KCl溶液代替［8］。计算结果以10-5mol/g表示，试验重复2次。

1.3.8 Ca2+-ATPase活性的测定

参考万建荣法［9］以及文献［10］测定 Ca2+-ATPase活性。酶反应混合液组成如表1。

进行反应时，按表1中混合液组成的配方，在试管中先将除ATP以外的其他成分混合好，将反应混合物放于25℃水浴中，待ATP溶液最后加入时，反应即开始，反应3 min，加入3 mL 15%TCA使反应停止，然后11 000 r/min离心2 min，取离心液4 mL加入试管中，加入3 mL Tris-MgCl2缓冲液(pH 7.5)，摇匀后在加入3 mL定磷试剂(20%Vc∶3mol/L H2SO4∶3%钼酸铵以等体积混合)，然后在45℃恒温水浴锅中反应30 min，在640 nm下测其吸光度。空白组用15%TCA代替。标准曲线用预先在100℃干燥1 h后置于干燥器中干燥冷却的KH2PO4，配制成0.5 mmol/L的溶液制作，标准曲线为 y=0.919 3x+0.011 1(R2=0.999 8)。计算结果以1 mg酶蛋白在1 min内生成的无机磷酸量μmol表示，即μmol/(min·mg)，试验重复3次。

表1 Ca2+-ATPase活性测定酶反应混合液组成Table 1 An enzyme reaction mixture for investigating activity of Ca2+-ATPase

1.4 数据处理

实验数据采用Microsoft Excel 2007进行统计分析。用SPSS 19.0进行方差分析(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 冻藏过程中持水力的变化

鱿鱼持水力可以用失水率来表示，失水率越高，说明持水力越差，失水率越低，则持水力越强。鱿鱼在-10、-20、-30和-40℃冻藏过程中失水率的变化如图1所示。

图1 鱿鱼冻藏过程中失水率的变化Fig.1 Rate of water loss changes of squid during frozen storage

从图1中可以看出，各冻藏温度下鱿鱼的失水率与冻藏时间有良好的相关性(r=0.989)，随着冻藏时间的延长，4组冷冻温度条件下的失水率均呈上升的趋势;相同冻藏时间内，温度越低，失水率越低，各温度间存在显著差异性(P＜0.05);冻藏至60d时，-10℃条件下的失水率增加量显著高于其他3组(P＜0.01)，冻藏至120 d时，-10℃和-20℃的失水率已经很高，只有-40℃仍然保持较低的失水率，其失水率为9.37%，此时-30℃的失水率为14.76%，与-40℃有显著差异性(P＜0.05)。肉的持水力的实质是肉的蛋白质自身或在加工过程中形成的空间网状结构，蛋白质分子亲水基团的暴露和毛细管力的共同作用，从而以物理方式捕获的水分量。捕获水量越多，则持水力越大［11］。冻藏过程中，蛋白质二级结构的有序性明显降低，由此判断由于冻藏引起肌动球蛋白(主要是肌球蛋白)的打开与伸展，暴露的非极性氨基酸与邻近的类似基团引起疏水相互作用，这个过程导致蛋白质的变性和聚集，表现为持水性能下降。蛋白质变性程度取决于冰晶的大小，慢速冷冻会造成大冰晶的形成，以至于蛋白质高度变性，产品持水力降低，冻藏温度越低，产品中心温度下降越快，-10℃和-20℃趋向于形成大冰晶，-30℃和-40℃趋向于形成小冰晶，因此冻藏温度越低，失水率越小，持水力越强。此外，虽然长期冷冻没有影响肉质的亚显微结构，但是冰晶的大小会逐渐增加，以至水分丢失［12］。

2.2 冻藏过程中pH值的变化

pH是衡量水产动物宰后品质变化的重要指标［13］。图2是鱿鱼在-10、-20、-30和-40℃冻藏条件下的pH值随时间变化情况。

图2 鱿鱼冻藏过程中pH值的变化Fig.2 pH changes of squid during frozen storage

由图2可见，4组鱿鱼的初始pH值在6.4左右，且在6.4～7.0之间波动，各温度之间无显著差异(P＞0.05);4 组贮藏温度分别在第 70、105、140、210 天时的pH值为6.77、6.59、6.69和6.72，冻藏60 d后-10、-20、-30和 -40℃的 pH值分别为6.79、6.74、6.66、6.64。以上结果说明，pH 值变化与冻藏时间和冻藏温度没有显著相关性，其原因可能是鱿鱼在低于-10℃的贮藏条件下，胴体肌球蛋白ATP酶和微生物的活性降低，不能分解产生氨类物质，中和pH，导致pH值的变化不显著。同时，胴体内大部分游离水在低温下得到冻结，从而使酶和微生物的活性降低。因此，不同贮藏温度条件下pH能一直保持在6.4～7.0之间，比较稳定，是与低温贮藏有关。

2.3 冻藏过程中TBARS的变化

图3是鱿鱼分别在-10、-20、-30和-40℃冻藏条件下不同时间的TBARS值的变化情况。由图3可见，4组鱿鱼的初始TBARS在0.07 mg MA/kg左右，4 种贮藏条件分别在第 70、105、140、210 天的TBARS 值为0.42、0.20、0.19、0.10 mg MA/kg。在冻藏过程中，-10℃的TBARS增加量明显高于其他3组(P＜0.01)，且-10℃冻藏下TBARS随着时间的延长而呈明显的上升趋势(r=0.944)，-20℃和-30℃下的TBARS和冻藏时间也有显著的相关性(r=0.984)，-40℃冻藏210 d后，TBARS仅比初始值增加了 0.03 mg MA/kg，这与 Hui-Hong 等［14］研究结果一致。本次实验测得最大的 TBARS值在0.4 mg MA/kg左右，国内对TBARS在食品中的限量还没有规定，国外推荐的TBARS阈值1～2 mg MA/kg。每100 g鱿鱼鲜品中含蛋白质16%～18%，脂肪1%～2%，因此鱿鱼的脂肪含量较低，所以在冻藏过程中TBARS值低于一般水产品。冻藏过程中，冰晶的形成使得磷脂质膜的细胞结构遭到破坏，磷脂质减少，释放出促氧化剂，比如游离铁，使得底物和酶之间直接接触［15］。此外贮藏温度越低，酶活性就越低，导致氧化速率降低，且氧化速率还与冻结速率有关。

图3 鱿鱼冻藏过程中TBARS的变化Fig.3 TBARS changes of squid during frozen storage

2.4 冻藏过程中FA的变化

鱿鱼在-10、-20、-30和-40℃冻藏过程中的FA变化如图4所示。图4可见，4组鱿鱼的FA随着冻藏时间的延长都显著增加(r=0.982)，其中-10℃和-20℃在前15 d甲醛含量由2 mg/kg左右快速上升到4 mg/kg左右，-30℃和-40℃在前30 d甲醛含量由2 mg/kg左右快速上升到4 mg/kg左右，随后，甲醛含量仍然呈上升趋势，不过上升速度减缓;相同冻藏时间内，-10℃甲醛含量最高，然后是-20、-30、-40℃最低。冻藏过程中TMA在TMAO酶的作用下会产生DMA和FA，TMAO降解的速率和多种因素有关，比如贮藏温度、物种、肌肉特性和还原条件，在鱼体捕获后前6周，氧化三甲胺酶活性一直上升，到第6周时达到最高，随后氧化三甲胺酶活性开始下降，到24周降到最低［15］。-10℃的贮藏温度相对于其他3个实验温度，氧化三甲胺酶的活性可能较高，导致最终甲醛的含量较高。贮藏温度越低，氧化三甲胺酶的活性越低，甲醛含量越低。Leelapongwattana等［16］研究发现，狗母鱼贮藏在-20℃时，随着冻藏时间的延长FA呈上升趋势，且真空处理要比空气处理上升的快，发现氧与TMAO酶发生抑制作用;他发现当TMA降解产生等摩尔的DMA和FA后，实际测得的FA含量小于DMA，说明FA和蛋白质侧链的不同官能基团发生反应，随后形成分子内和分子间的亚甲基桥，这加剧了冻藏时蛋白质变性，一旦FA和蛋白质结合，蛋白质二级结构就会伸展，发生聚集，并且聚集物不断增加，导致了蛋白质溶解度的下降。

图4 鱿鱼冻藏过程中FA的变化Fig.4 FA changes of squid during frozen storage

2.5 冻藏过程中盐溶性蛋白含量的变化

目前，国内对于水产品类蛋白冷冻变性的研究，常常是通过测定鱼肉中的Ca2+-ATPase活性、盐溶性蛋白含量、以及巯基数量等指标，来分析淡水鱼蛋白质冷冻变性的程度。鱿鱼在-10、-20、-30和-40℃冻藏过程中盐溶性蛋白的含量变化如图5所示。从图5中可以看出，4组盐溶性蛋白含量初始值为44.51 mg/g，随着冻藏时间的延长，4组鱿鱼中盐溶性蛋白含量均呈下降趋势(r=0.929)，4种贮藏条件分别在第70、105、140、210天时盐溶性蛋白含量分别为15.50、16.44、16.69、22.44 mg/g，相同冻藏时间内，-10℃的盐溶性蛋白含量下降最多，依次为-20、-30、-40℃，各温度之间存在显著性差异(P＜0.05);冻藏至60 d时，-10℃的盐溶性蛋白减少量显著高于其他3组(P＜0.01)，冻藏至120 d时，-30、-40℃盐溶性蛋白含量分别为21.42、26.00 mg/g。这和2.1试验结果中冻藏引起鱿鱼持水力降低的现象相关。盐溶性蛋白是鱼肉中重要的功能性蛋白，-10℃的盐溶性蛋白减少量显著高于其他3组，导致鱿鱼持水力显著低于其他3组。-30、-40℃的储藏条件，由于温差较大，冷冻速冻较快，肌肉中形成的冰晶较小，对蛋白网络的机械破坏作用小，因而，盐溶性蛋白的含量相对较多。冻藏引起鱼肉肌动球蛋白(主要是肌球蛋白)的打开与伸展，暴露的非极性氨基酸与邻近的类似基团引起疏水相互作用，这个过程导致了蛋白质的变性［17］。在冻藏过程中，巯基氧化形成的二硫键会导致肌球蛋白重链的聚合，从而降低其盐溶性。蛋白质的部分结合水形成冰晶而析出，导致肌动球蛋白分子之间相互形成非共价键，进而形成超大分子的不溶性凝聚体使肌动球蛋白溶出量下降。另外肌动球蛋白变性后，会产生一种在高离子强度下不溶解但在碱液中可以溶解的蛋白质，即碱溶性蛋白质，也会导致肌动球蛋白在冻藏过程中溶解度的下降。

图5 鱿鱼冻藏过程中盐溶性蛋白的变化Fig.5 Salt soluble protein content changes of squid during frozen storage

2.6 冻藏过程中活性巯基含量的变化

图6表示了鱿鱼在-10、-20、-30和-40℃冻藏过程中活性巯基的含量变化。由图6可知，随着冻藏时间的延长，4组鱿鱼中活性巯基含量均呈显著下降趋势(r=0.952)，4组活性巯基含量初始值为22.97×10-5mol/L，在冻藏初期活性巯基含量快速下降，冻藏至60 d时，4组活性巯基含量分别为5.99×10-5、8.37 × 10-5、14.81 × 10-5、17.10 × 10-5mol/L，同一时间不同贮藏温度，鱿鱼巯基含量差异显著，特别是15 d后，-30℃和-40℃贮藏的鱿鱼巯基含量显著高于其他2组。鱿鱼冻藏过程中活性巯基含量下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纤维蛋白空间结构发生改变，使埋藏在分子内部的疏基活性基团(巯基SH1)暴露出来，易于发生巯基氧化和二硫化物的置换，导致活性巯基含量减少［16］。活性巯基的减少意味着分子间或分子内的二硫键的形成，氢键和疏水键的形成掩盖了在肌动球蛋白分子内的活性巯基。此外，FA的大量形成导致了蛋白聚集增加，从而加剧了巯基的氧化。-30℃和-40℃相对于其他2组的贮藏条件，形成的冰晶较小，对蛋白质空间结构破坏较小，对活性巯基的保护较好。说明-10℃和-20℃不能很好的保持鱿鱼品质，-30℃和-40℃为较好的温度。

图6 鱿鱼冻藏过程中活性巯基含量的变化Fig.6 Activesulfydryl content changes of squid during frozen storage

2.7 冻藏过程中Ca2+-ATPase活性的变化

冷冻储藏会导致蛋白质变性，ATPase活性部位也会发生变化，所以，测定肌动球蛋白Ca2+-ATPase活性被广泛用来作为判定鱼肉冻藏品质变化的指标。图7表示了鱿鱼在-10、-20、-30和-40℃冻藏过程中的Ca2+-ATPase活性变化。从图7中可以看出，4组鱿鱼Ca2+-ATPase活性初始值为12.71×10-2μmol/min·mg，随着冻藏时间的延长，4组的Ca2+-ATPase活性均呈下降趋势(r=0.968)，且温度越低，下降程度越小。冻藏至60 d时，-10℃的Ca2+-ATPase活性减少量显著高于其他3组(P＜0.01)，冻藏至120 d时，-10℃和-20℃的Ca2+-ATPase活性已经很低，此时-30℃和-40℃的Ca2+-ATPase活性分别为 5.47 ×10-2、7.74 ×10-2μmol/min·mg。引起冻藏过程中鱼肉肌原纤维蛋白质Ca2+-ATPase活性下降的原因目前有以下几种:Lian等认为是由于冰晶的机械作用引起的，也有很多研究者认为是由pH值下降引起的，还有许多的研究认为，ATPase活性下降的主要原因是由于巯基氧化形成二硫键导致分子聚合，通过前文对pH的研究，作者认为ATPase活性下降是由冰晶机械作用及巯基氧化作用引起的。这和盐溶性蛋白含量，巯基含量及持水力降低趋势相关，冷冻对蛋白质空间网络的机械破坏，降低了肌球蛋白的酶活力，导致蛋白质变性，功能性盐溶性蛋白含量及巯基含量减少，从而使蛋白质的持水力降低。冻藏的温度越低，冰晶对蛋白质的机械破坏越小，蛋白质变性程度越低，盐溶性蛋白和活性巯基的含量相对较高，Ca2+-ATPase的活性也较高。ATPase活性与肌球蛋白的球状头部基团有关，ATPase活性的下降意味着肌球蛋白的构象的变化，特别是头部部位，以及蛋白质聚集;蛋白质分子间的重新排列也会导致ATPase活性的下降;FA作为有效的交联剂，通过亚甲基桥使蛋白质聚集，特别是肌球蛋白的头部部位［18］。

图7 鱿鱼冻藏过程中Ca2+-ATPase活性的变化Fig.7 Ca2+-ATPase activity changes of squid during frozen storage

3 结论

鱿鱼在4组不同冻藏温度条件下，鱿鱼的pH值在6.4～7.0之间，各温度之间无显著差异(P＞0.05)，低于-10℃的冻藏温度，鱿鱼的pH不随温度的变化而显著变化。因此，pH值不能作为评价鱿鱼品质变化的指标。

4组冻藏温度条件下，鱿鱼的盐溶性蛋白含量、活性巯基含量和Ca2+-ATPase活性都随冻藏时间的延长而显著降低，冻藏的温度越低，冷冻对上述有关的蛋白质指标影响越小，盐溶性蛋白、活性巯基含量和Ca2+-ATPase活性显著提高，从而，鱿鱼的失水率降低，鱿鱼的品质越好。同时，鱿鱼的 FA含量和TBARS值也降低。从这一点看，本文研究的结果说明，-30℃和-40℃的冻藏条件对鱿鱼品质的保护要显著优于-10℃和-20℃，结合冻藏的经济性及储藏时间，本研究建议，采用-30℃的冻藏温度对鱿鱼的保存比较合适。

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