HPLC法同时测定楚雄臭菜中槲皮素和山奈酚的含量

郭向群，曹建民，张志琴

0 引言

楚雄臭菜是云南省楚雄地区彝族群众广泛食用的一种木本植物的幼嫩枝叶或芽尖，能清降火气或热毒，具有药食两用的价值。2009年5月，中国科学院昆明植物所的李恒研究员鉴定为马鞭草科大青属“西垂茉莉 Clerodendrum griffithianum C.B.Clarke”［1］。笔者在对楚雄臭菜中的有效成分进行分离鉴定后，发现楚雄臭菜中含有槲皮素和山奈酚等黄酮类化合物。槲皮素具有祛痰、止咳、降压、降血脂等作用［2］，可抑制多种恶性肿瘤细胞生长［3-4］;山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌等多种功效［5］;槲皮素和山奈酚具有明显的降血压、降血脂、抗氧化剂等作用［6］。目前，楚雄臭菜中槲皮素和山奈酚的含量测定未见报道。本研究建立了HPLC法同时测定楚雄臭菜中槲皮素和山奈酚的含量，该方法分离度高，重复性好，简便易行，可作为楚雄臭菜药材的含量测定方法，为楚雄臭菜进一步开发利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪LC-20A(日本岛津)，二级管阵列检测器SPD-M20A(日本岛津)，自动进样器SIL-20AC(日本岛津);SartoriusAGBS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司);As10200型超声波清洗机(北京华博科技制造有限公司)。

1.2 试药 槲皮素对照品(批号:100081-200907，中国食品药品检定研究院)，山奈酚对照品(批号:110861-200808，中国食品药品检定研究院);乙腈为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。楚雄臭菜药材采自云南省楚雄州各县(市)，经鉴定为楚雄臭菜。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［7］色谱柱:InertSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)－0.3%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0 ～5.00 min，A∶B=20∶80;5.01 ～12.00 min，A∶B=40∶60;12.01 ～25.00 min，A∶B=15∶85)。检测波长:360 nm;流速:0.8 mL/min;柱温:30℃;进样量10 μL。对照品溶液、供试品溶液的色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图注:A.对照品溶液，B.样品溶液;1.槲皮素，2.山奈酚

2.2 对照品制备 分别取槲皮素和山奈酚对照品，精密称定，用甲醇超声(功率:250 W，频率:40 kHz)溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL分别含槲皮素0.170 mg和山奈酚0.190 mg的混合对照品储备液。精密吸取储备液1 mL，稀释为10 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。

2.3 供试品溶液制备 取楚雄臭菜粗粉(过24目筛)2 g，精密称定，精密加入甲醇－25%盐酸(4∶1)混合溶液50 mL，精密称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，续滤液再经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察 按“2.1”项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液 2、4、8、10、12、16 μL，分别注入液相色谱仪，测定槲皮素与山奈酚峰面积，以进样量(μg)为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，相关组分的回归方程、回归系数、线性范围见表1。结果表明，在该色谱条件下，槲皮素和山奈酚的进样量在线性范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表1 槲皮素和山奈酚的回归方程、相关系数、线性范围

2.5 精密度试验 吸取含槲皮素0.017 mg/mL和山奈酚0.019 mg/mL的同一份混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件，连续测定 6 次，测得槲皮素峰面积的RSD为1.88%，山奈酚的RSD为1.67%，结果表明，所用仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取同一批楚雄臭菜粗粉(过24目筛)6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行分析，测得槲皮素和山奈酚质量分数的RSD分别为1.23%和0.56%，结果表明，该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于配制后 0、2、4、6、8、12、24 h 进样 10 μL，测得槲皮素和山奈酚的峰面积RSD分别为0.85%和1.32%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 准确称取已知槲皮素和山奈酚含量的楚雄臭菜粗粉(过24目筛)6份，每份约2 g，分别加入槲皮素与山奈酚对照品适量，按“2.3”方法制备供试品溶液。测得槲皮素的平均回收率为99.33%(n=6)，RSD=1.33%;山奈酚的平均回收率为 99.48%(n=6)，RSD=1.85%。见表2。

2.9 样品的测定 取采自云南楚雄不同地区的6批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，记录峰面积，分别计算槲皮素和山奈酚的含量。见表3。

表2 槲皮素和山奈酚加样回收试验结果

表3 云南楚雄产几种臭菜中槲皮素和山奈酚含量的测定结果(mg/g)

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 黄酮类化合物多有酸性，而药材中的槲皮素和山奈酚多以苷的形式存在［3］，为了使槲皮素游离，常在提取溶剂中加入一定量的酸进行水解。笔者考察了甲醇、甲醇－4%硫酸(4∶1)、甲醇 －37%盐酸(4∶1)、甲醇 －25%盐酸(v/v)(4∶1)、甲醇 －盐酸(25 mL→100 mL)等溶剂。结果显示，甲醇－25%盐酸(4∶1)为提取溶剂时提取效果最优。

3.2 提取方法选择 考察了浸渍、回流、连续回流、超声等提取方法，结果显示，加热回流提取效果较好，因此采用回流法提取。

3.3 流动相系统选择 考察了甲醇－水、甲醇－0.1%磷酸、乙腈－0.1%磷酸、乙腈－0.3%磷酸等度和梯度洗脱，结果用乙腈－0.3%磷酸梯度洗脱进行分离效果较好。

3.4 检测波长的选择 以二极管阵列检测器对槲皮素、山奈酚对照品混合溶液在上述色谱条件下，于波长200～400 nm绘出3D图谱，结果槲皮素对照品溶液在372 nm波长处有最大吸收峰，山奈酚对照品溶液在368 nm波长处有最大吸收峰，其HPLC色谱响应较大，同时各色谱峰分离度较好，为兼顾槲皮素和山奈酚进行同时测定，选择365 nm为检测波长。

3.5 建立的方法能快速、简便、准确地测定楚雄臭菜幼嫩叶中槲皮素和山奈酚的含量，该方法的稳定性、重复性和回收率均较好，对楚雄臭菜药材的质量控制有实际的应用意义，为楚雄臭菜药材的质量评价提供依据。

3.6 根据色谱图可知，楚雄臭菜除槲皮素和山奈酚外，尚有很多未知色谱峰，有待进一步分析研究。

［1］ 徐写秋，刘本玺.“楚雄臭菜”的民族植物学特征和持续利用研究［J］.绿色科技，2012，(6):107-108.

［2］ 崔山风.槲皮素的研究进展［J］.西北药学杂志，2006，21(6):279-281.

［3］ 游璐茜，吴振，赵玉芬.木中槲皮素、山奈酚和杨梅素含量的高效液相色谱法测定［J］.化学通报，2009，(10):896-900.

［4］ 肖洁，牛国敏，尹松梅，等.槲皮素联合硼替佐米或雷利度胺对抑制HL-60细胞增殖的影响［J］.实用医学杂志，2014，30(14):2196-2199.

［5］ 陈育华，周克元，袁汉尧，等.山奈酚药效的研究进展［J］.广东药学，2010，31(8):1064-1066.

［6］ 典灵辉，吴铁，吕应年，等.HPLC法测定黄芪中槲皮素和山奈酚的含量［J］.现代医药卫生，2007，23(17):2550-2551.

［7］ 覃兰芳，胡琦敏，赖茂祥，等.HPLC同时测定小蜡树叶中槲皮素与山奈素的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(2):107-109.