表面活性剂法检测高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）的研究

王贤俊

（温州市维日康生物技术研发中心，浙江温州325041）

表面活性剂法检测高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）的研究

王贤俊

（温州市维日康生物技术研发中心，浙江温州325041）

高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）主要为ApoA1，ApoA1的降低与动脉粥样硬化性心血管疾病的发病率［1］密切相关，目前在临床工作中应用较广的HDL－C测定方法有肝素－锰沉淀法、PTA－Mg2＋法、PEG修饰酶法（PEGME法）［2，3］、PEG／抗体包裹法（IRC法）［46］、抗体免疫分离法（AB法）［6，7］及匀相法等。本文采用匀相法，选择两种不同的表面活性剂及多聚阴离子，根据脂蛋白的酶反应选择性，直接测定HDL－C的浓度，并与日本第一化学药品株式会社试剂盒进行对比，对该参考试剂的所有性能指标进行全面分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂 参考试剂为高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）检测试剂盒（温州市维日康生物科技有限公司）；对比试剂为磷钨酸镁法试剂盒（北京中生公司），PEG修饰酶法试剂盒（卫生部临床诊断试剂实验中心，进口分装），高密度脂蛋白胆固醇匀相法检测试剂盒（日本第一化学药品株式会社）。

1.1.2 仪器 奥林帕斯AU2700全自动生化分析仪和日立7600全自动生化分析仪两种机型进行实验，具体方法的操作规程见文献［8］。

1.2 实验方法

1.2.1 反应完成度 由于本次参考试剂采用的计算方法为终点法，要求反应在尽可能短的时间达到反应终点。所以本次试验观察反应曲线在200秒时的反应完成度。取低、中、高三种浓度的血清分别进行测定并记录反应曲线，观察反应完成度。HDL－C血清浓度分别为0.51、1.42、3.24mmol／L。

1.2.2 线性范围 本参考试剂的线性范围为0.01－3.57mmol／L。每个浓度重复测定3次取平均值，对测定值与预期值作回归分析。

1.2.3 反应特异性 为了判断参考试剂对HDL－C反应的特异性，即只于HDL－C反应而不与LDL－C发生反应。取一份血清（LDL－C 2.18mmol／L、HDL－C 1.47mmol／L）分为500μL 10等份，向其中分别加入0.2μmol，0.35μmol，0.5μmol，0.65 μmol，0.8μmol，0.95μmol，1.05μmol，1.2μmol，1.35μmol，1.5μmol的LDL－C纯品，混匀后对10份血清分别进行测定。

1.2.4 回收试验 分别取0.9ml的5份血清样本中（浓度分别为0.47mmol／L、0.85mmol／L、1.25mmol／L、1.69mmol／L、2.07mmol／L）加入0.1mL的标准溶液（浓度为3.28mmol／L），每个浓度重复检测3次，分别测定其回收值并计算回收率。

1.2.5 测量精密度 取低、中、高三份HDL－C浓度的混合血清在相同条件下，用参考试剂分别对三份混合血清进行日内和日间重复性试验，日内重复性试验每份血清重复检测20次，日间重复性试验每份血清连续检测20天。

1.2.6 干扰试验 分别取6份1ml的相同血清，其中一份做为对照，其他5份分别加入甘油三酯5.6mg，胆红素0.2mg，血红蛋白浓度5.0mg，维生素C 8.0mg，脂肪剂10mg，混匀后用参考试剂进行测定，并记录实验结果。

1.2.7 方法对比试验 本次试验血清样本数量为50份，其浓度分配为低值占30%，正常值占40%，高值占30%，采取双份测定样本，第一次测定为顺序，第二次为反向顺序测定。将参考试剂与PTAMg2＋法、PEG修饰酶法及日本一化试剂进行比较，测定结果进行回归分析。

2 结果

2.1 反应完成度 反应曲线图中300秒处为加入试剂二，加入试剂二后反应正式开始，观察三个浓度水平的反应曲线可以发现，从300秒开始至400秒反应基本达到终点，在500秒时已经达到反应终点，故参考试剂在200秒内反应完成度良好（见图1）。

2.2 线性范围 线性相关系数r2为0.998，表明0.01－3.57mmol／L范围内线性关系良好。结果如图2所示。

2.3 反应特异性 如图3所示，当LDL－C最终浓度达到5.18mmol／L时，本法测出的HDL－C值未升高，表明加入LDL－C不会使HDL－C测定值升高，该试剂盒特异性良好。

图1 试剂反应曲线

图2 试剂线性趋势图

图3 特异性反应曲线

2.4 回收试验 参考试剂回收试验结果良好，见下表1。

2.5 精密度 精密度实验表明，批内精密度和批间精密度分别1.32%－1.89%和1.69%－2.15%，结果见表2。

表1 本法对不同浓度HDL－C标本检测的回收率

表2 日内、日间精密度结果

2.6 干扰试验 试验结果表明甘油三酯≤8.7 mmol／L，胆红素≤342μmol／L，血红蛋白≤5g／L，维生素C≤8g／L，脂肪剂≤10mg／mL对测定结果没影响。结果见表3。

表3 干扰试验结果

2.7 方法对比试验 参考试剂方法与PTA－Mg2＋法、PEG修饰酶法、日本一化法的结果相关性均良好。参考试剂的结果（Y）与PTA－Mg2＋法（X1）、PEG修饰酶法（X2）和日本第一化学试剂（X3）相关良好，分别为Y＝0.982 X1＋0.037（r2＝0.9905，n＝50），Y＝0.991 X2＋0.040（r2＝0.9915，n＝50），Y＝0.987 X3＋0.043（r2＝0.9922，n＝50）。对比结果见图4、5、6。

图4 HDL－C直接法与PTA－Mg2＋法的比较

图5 HDL－C直接法与PEG修饰酶法的比较

图6 HDL－C直接法与日本一化的比较

3 讨论

本次实验选用的高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）检测试剂盒（温州市维日康生物科技有限公司）采用表面活性剂消除法，属于匀相法，试剂为液体双试剂。试剂一中的表面活性剂a能改变除HDL以外的脂蛋白结构并解离，解离后的微粒化胆固醇分子被胆固醇酶分解成胆甾烯酮、脂肪酸和H2O2，其中生成的H2O2因缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时HDL颗粒仍完整。当加入含有表面活性剂b的试剂二时，能使HDL颗粒解离释放出胆固醇分子，此时生成的H2O2由于试剂二中含有偶联剂DSBmT，所以参与完整Trinder反应而显色，由于其他脂蛋白解离出的胆固醇分子在前一步反应中已被除去，所以此时显色产生的吸光度变化多少与样本中HDL－C含量成比例。

综上所述，本研究实验表明了HDL－C表面活性剂直接法检测试剂反应完成度、线性范围、特异性、准确度、精密度、抗干扰等性能指标均优异。且拥有液体双试剂稳定性好，简便快速准确的特点，而与参考方法及其国外同类试剂的方法对比实验表明了它们具有良好的一致性，符合临床的检测要求。

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［3］白书堂，李建丽，郭占军.高密度脂蛋白胆固醇匀相测定技术进展［J］.齐鲁医学检验，2003，5（14）：1

［4］Harris N，Galpchian V，Rifai N.Three routine metheds for measuring high－density lipoprotein cholesterol compared with the reference method［J］.Clin Chem，1996，42（5）：738.

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［8］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.第3版.南京：东南大学出版社，2006：485－487.

2015－03－26）

1007－4287（2015）10－1760－03