miR－222在急性心肌梗死诊断的意义

罗 婠，熊 辉，韩 露，马 培，周 新

（武汉大学中南医院基因诊断中心，湖北武汉430071）

miR－222在急性心肌梗死诊断的意义

罗 婠，熊 辉，韩 露，马 培，周 新＊

（武汉大学中南医院基因诊断中心，湖北武汉430071）

目的研究血浆miR－222在急性心肌梗死患者中的表达水平变化。方法 收集患者发生急性心肌梗死后24小时内的全血，分离血浆提取总RNA，茎环法特异性逆转录为cDNA，以RNU6为内参基因，采用real－time qPCR方法检测49例急性心肌梗死患者和31例健康对照者血浆中miR－222的表达水平。结果 miR－222在心梗组中的表达量为0.766（0.184，2.463），对照组表达量为0.149（0.027，0.213），采用非参数Mann Whitney U检验统计显示，急性心肌梗死组miR－222表达水平明显高于对照组（U＝291，P＜0.01）。ROC曲线下面积（AUC）为0.808（95%CI 0.714－0.913），miR－222诊断AMI的灵敏度和特异度分别为65.0%和93.5%。结论 急性心肌梗死患者血浆miR－222在心梗发生后24小时内表达量显著升高，miR－222可能对于急性心肌梗死的诊断具有一定价值。

急性心肌梗死；血浆；微小RNA；实时荧光定量PCR

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1664）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是临床最常见的最严重的急性心肌缺血性疾病，发达国家的发病率高于我国，但随着社会的发展，人口老龄化、生活方式及饮食习惯的变化使得我国的AMI发病率呈逐年上升的趋势［1－3］。血浆中肌红蛋白、肌钙蛋白（cTn）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK－MB）检测为诊断AMI的金标准。近年来，随着国内外对于miRNA研究得深入，其在各种疾病的发生发展过程中逐渐被人们所知。在心血管系统，miRNA已被证明在内皮功能障碍、细胞凋亡、血管生成等病理生理条件下有重要的作用［4，5］，台湾有学者［6］研究发现与心肌损伤等病理过程相关的miRNA也能作为诊断急性心肌梗死的生物标志物，本研究通过观察急性心肌梗死患者血浆miR－222水平的变化，探讨其在AMI诊断中的意义。

1 对象与方法

1.1 对象 2014年3－8月在武汉大学中南医院心血管内科收治的急性心肌梗死49例，男患者32例，女患者17例，年龄（64±12）岁，诊断符合中华医学会心血管分会《急性心肌梗死诊断和治疗指南》标准。对照组31例，来自武汉大学中南医院同期体检健康者，男20例，女11例，年龄（64±7）岁。

1.2 实验方法

1.2.1 血浆总RNA的提取 病例组患者在典型胸痛24h内并在治疗前，正常对照者在空腹8h后，采集外周静脉血，EDTA－Na2抗凝。1小时内（室温或4℃放置）12 000g，离心8min，分离血浆后采用QIAGEN公司miRNeasy Serum／Plasma Kit试剂盒提取总RNA，Nano drop 2000c分光光度仪检测RNA浓度及纯度。逆转录反应采用TAKARA公司PrimeScript RT reagent KIT试剂盒，茎环法特异性逆转录为cDNA，miR－222和RNU6的逆转录引物序列分别为：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCAGTA和CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。反应体系：2μl 5xPrimeScript Buffer，0.5μl PrimeScript RT Enzyme Mix，0.5μl特异性引物（20μM），2μl Total RNA，5μl RNase－Free Water。程序设置为：42℃15min，85℃5s。反应完成后cDNA－20℃冰箱保存。

1.2.2 miRNAs的克隆验证测序 扩增普通PCR并经电泳鉴定目的片段。用AXYGEN公司PCR Cleanup Kit试剂盒纯化回收普通PCR产物，TAKARA公司pMD－19T载体连接纯化产物，转化克隆后交由上海睿迪公司测序验证扩增片段是否正确。PCR扩增引物序列见表1。

表1 miR－222及RNU6扩增引物序列

1.2.3 Real－time qPCR检测 将miR－222和RNU6质粒倍比稀释成6个不同浓度，进行荧光定量PCR检测，制作标准曲线，以观察引物扩增效率。PCR试剂SYBR Premix Ex Taq II TM购于TAKARA公司。反应体系：10μl 2xSYBR Premix Ex TaqTM II；1μl特异性上游引物；2μl Universal Primer；6μl RNase－Free Water。程序依次如下：95℃30秒；3步循环—95℃5秒，55℃30秒，72℃30秒，45个循环。每个标本设3个复孔。

1.3 统计学分析 Real－time qPCR结果采用相对定量（2－ΔCt）方法进行分析。计算每个样本三个复孔的Ct值均值作为实际样本Ct值，减去同一样本内参的Ct值均值，得到ΔCt值，再求得2－ΔCt值。运用SPSS 13.0统计学软件，正态资料用均值±标准差表示，采用独立样本t检验；非正态资料用中位数（四分位数区间）表示，采用非参数Mann Whitney U检验进行统计分析。受试者工作曲线（ROC曲线）判断血浆miR－222诊断的灵敏度和特异度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 克隆测序验证结果 普通PCR扩增目的片段，转化克隆后进行测序验证，测序结果经BLAST比对显示扩增片段miR－222及RNU6序列均正确。2.2 引物扩增效率验证 可接受的有效的荧光定量PCR标准曲线斜率（sloop）应在－3～－3.5之间，相关系数（R2）应大于0.98，PCR扩增效率（E）在90%－110%之间。所有目标片段的扩增均符合以上要求。说明运用荧光定量PCR反应检测目的RNA表达水平是稳定可靠的。

2.3 荧光定量PCR扩增曲线 本实验采用荧光定量PCR方法测定miRNA表达水平，Ct值小于35认为是有效扩增，本研究Ct值均在27－35之间，结果合理可信。

2.4 miR－222表达水平 分析49例AMI患者与31例对照者血浆miR－222相对表达量，心梗组为0.7658（0.1838，2.4628），对照组表达量为0.1492（0.0265，0.2132），急性心肌梗死组血浆miR－222表达量显著升高（U＝291，P＜0.01），且心梗组miR－222含量比对照组高出4倍左右。见表2。

表2 心梗组与对照组miR－222相对表达量比较

2.5 ROC曲线 以miR－222相对表达量绘制ROC曲线，曲线下面积（AUC）为0.808，miR－222对于AMI的诊断灵敏度和特异度分别为65%和93.5%。miR－222诊断AMI有较高价值。见图1。

图1 MiR－222诊断AMI的ROC曲线

3 讨论

自1993年第一次发现miRNAs以来，估计基因组中大概存在2000多种miRNAs，调控60%以上的蛋白编码基因［7］。miRNAs的异常升高或降低可引起多种疾病［8］。

很多研究已经观察到miRNA在急性心肌梗死的患者血清／血浆中可发生变化，Wang等［9］发现在AMI患者血浆miR－1、miR－133a、miR－499和miR－208a的表达水平均明显高于正常人和非AMI患者。今年国内有研究者发现血浆miR133、miR－1291和miR－663b在AMI患者中明显高于非AMI患者［10］，且ROC Curve分析显示，miR133、miR－1291和miR－663b均具有较高的诊断特异性和敏感性；该研究并发现ST段抬高心肌梗死（STEMI）患者术后这三种miRNA水平均有不同程度的下调。He［11］等在359例AMI患者中血浆样本中检测了miR－328和miR－124的表达水平，并进行了生存分析，结果表明miR－328和miR－124的表达水平显著升高，且由于miRNA表达水平升高导致患者发生心衰或死亡的风险增加。

此前已有报道证实miR－222参与多种炎症反应，并在多种疾病的发生、发展过程中扮演着重要的角色。其中有学者在研究中发现糖尿病和高脂血症诱发的炎性反应可以通过选择性下调miR－222的水平，以此上调间隙连接蛋白Cx43和Rho激酶的表达，从而刺激血管收缩［12］。通过对miR－222靶基因的预测，发现miR－222调控包括细胞周期蛋白在内的多种基因，推测miR－222有可能通过影响心肌细胞活动和血管反应参与到心血管疾病中。本研究发现血浆miR－222表达水平在AMI患者发作24小时内明显升高（U＝291，P＜0.01），ROC曲线下面积为0.808，说明miR－222对于AMI的诊断具有较高的价值；灵敏度和特异度分别为65%和93.5%，具有较高特异度。

在临床上将miRNA的表达和现有的心梗标志物肌红蛋白、肌钙蛋白（cTn）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK－MB）等联合，可能为急性心肌梗死的诊断提供一条新的途径。多种miRNAs表达谱的变化可能会更加灵敏诊断甚至早期预判心梗的发生。

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Association of Plasma miR－222 Expression Level with Acute Myocardial Infarction

LUO Wan，XIONG Hui，HAN Lu，et al.
（Center for Gene Dignosis，Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071，China）

ObjectiveTo evaluate the plasma miR－222expression level as a diagnostic biomarker for acute myocardial infarction（AMI）.Methods The patients’blood was collected after AMI occurred in 24hours，Total RNA was extracted from separated plasma，stem－loop method was used to reverse transcript cDNA.RNU6as reference gene.The relative expression levels of plasma miR－222in 49AMI patients and 31health control were measured by real－time qPCR.Results The expression level of miR－222was significantly increased in AMI［0.766（0.184，2.463）］than health group［0.149（0.027，0.213）］（U＝291，P＜0.01）.The sensitivity and specificity of miR－222for diagnosing AMI were 65.0%and 93.5%respectively.The AUC（area under the curve）of ROC curve was 0.808（95%confidence interval 0.714－0.913）.Conclusion Plasma miR－222was up－regulated in AMI group，which may serve as a potential diagnostic biomarker for AMI.

acute myocardial infarction；plasma；miRNA；real－time qPCR

R542.2＋2

A

罗婠（1990－），女，硕士研究生，研究方向：重大疾病的分子诊断；周新，教授，博士生导师。

2014－12－30）

1007－4287（2015）10－1664－03

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2012CB720600）

＊通讯作者