切断阴部神经建立女性压力性尿失禁大鼠模型的可行性实验研究

初茂林，张春影，修有成

(1.哈尔滨医科大学附属第二医院泌尿外二科，黑龙江哈尔滨 150086；2.哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外三科，黑龙江哈尔滨 150001)

·基础研究·

切断阴部神经建立女性压力性尿失禁大鼠模型的可行性实验研究

初茂林1，张春影1，修有成2

(1.哈尔滨医科大学附属第二医院泌尿外二科，黑龙江哈尔滨 150086；2.哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外三科，黑龙江哈尔滨 150001)

目的 探讨切断阴部神经建立女性压力性尿失禁动物模型的可行性。方法 选取健康雌性青春期大鼠40只，随机分为阴部内神经切断组、对照组各20只，所有样本均进行喷嚏试验、腹部漏尿点压力检测及尿道组织学检查。结果 阴部内神经切断组腹部漏尿点压力比手术对照组降低、喷嚏试验阳性；HE染色及免疫组化试验均为阳性。对照组喷嚏试验阴性。压力性尿失禁模型建立成功率为85%。结论 切断阴部神经建立女性压力性尿失禁大鼠模型是可行的，在模型的制作中组织学检查提供了可靠的病理学基础。

压力性尿失禁；动物模型；腹部漏尿点压力；喷嚏实验；大鼠

女性压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是一种中老年妇女的常见病[1]。国际尿控学会(International Continence Society，ICS)对SUI定义是指膀胱压力大于最大尿道压力时, 逼尿肌没有收缩的情况下尿液从外尿道外口不自主流出。尿失禁多数在患者咳嗽或运动腹压增大时发生，患者多为中老年妇女。流行病学资料显示，尿失禁总患病率11%～57%，我国尿失禁患病率约26.7%，SUI为18.6%[1]，年龄增长、盆底肌肉损伤等是引起SUI的常见原因，这些因素可以导致盆底肌肉，韧带结构改变，导致尿道和阴道的解剖异常[2-3]。其他因素还包括肥胖、慢性咳嗽、多产、吸烟和便秘等，经阴道分娩是SUI产生的最常见的原因。现今压力性尿失禁的治疗方法都存在不同的缺陷，故研究出副作用少、治愈率高的治疗方法非常重要[4-5]。建立SUI动物模型可以更好地研究SUI的发病机制，更直观地评价临床各种治疗SUI方法的疗效和并发症，为治疗方案的进一步改进提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 实验动物 健康雌性Wistar 大鼠40只，鼠龄10～12周，体重200～250 g。随机分为阴部内神经切断组、手术对照组各20只。

1.1.2 试剂 PGP9.5兔抗鼠酶标抗体，兔二步法检测试剂盒，DAB显色剂，PBS缓冲液。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 ①麻醉时应用水合氯醛，浓度为10%，按每公斤体重3 mL的剂量进行腹腔内注射[6]；②备皮，术区75%乙醇浸泡3 min消毒，大鼠俯卧位在手术台上固定；③在大鼠背侧碘伏消毒后纵行切开皮肤约1.5 cm，打开肌层，分离脊柱两侧的肌肉，在坐骨直肠窝内，仔细寻找，可以找到略黄色的坐骨神经，沿坐骨神经向远端分离，在坐骨神经起源的远端可以找到通向尿道膀胱方向的神经分支，为阴部内神经，切断切除阴部内神经约2～3 mm；④对照组手术方法同前，但神经不切断。⑤常规饲养2周。

1.2.2 结果判定方法 ①喷嚏试验：将大鼠固定，首先排空膀胱，向膀胱内灌注膀胱容量1/2的美兰盐水混合液，然后剪取一段鼠须刺激大鼠鼻腔，诱导大鼠喷嚏反射，观察大鼠尿道口有无美兰液流出，有美兰液溢出为阳性，没有美兰液溢出为阴性。②腹部漏尿点压力检测：准备尿动力学检查仪器，10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔内注射麻醉，仰卧固定大鼠；尿道外口用75%的乙醇消毒，然后用眼科小镊子提起，硬膜外导管应用石蜡油完全润滑，插入尿道，深度约3 cm，固定好，先把膀胱内的尿液排出，输液泵连接在导管另一端，检查无漏夜后，缓慢输入37 ℃美兰和生理盐水的混合液，并对尿道外口进行观察，尿道外口有美兰液流出时记录输入膀胱液体量，即测出最大膀胱容量；应用硬膜外导管排空膀胱，再灌注0.5倍膀胱容量的美兰生理盐水混合液，拔出导管。在大鼠直肠内插入F3气囊导管，气囊内注入0.15 mL生理盐水导管另一端连接压力转换器测定压力，用手在大鼠腹壁上缓慢加压， 观察膀胱压力上升情况; 注意监测尿道外口变化，当有尿液溢出尿道口时，马上记录下当时的膀胱压力，这便是测出的腹部漏尿点压力。③组织学检测：喷嚏试验，尿动力学检测完毕后，取大鼠膀胱颈尿道括约肌处组织，4%多聚甲醛固定约18～24 h，制备石蜡切片。

1.3 统计学分析 采用统计软件SPSS13.0，数据采用 表示，应用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 喷嚏试验结果 阴部内神经切断组动物20只，诱发喷嚏时有17只尿道口有尿液流出，阳性率为85%(17/20)；对照组大鼠诱发喷嚏时尿道口未发现流出美兰液。阴部内神经切断组阳性率明显高于手术对照组(P<0.05)，差异有统计学意义，模型成功率85%。

2.2 尿动力学检测结果 阴部内神经切断组的最大膀胱容量、漏尿点压力均小于手术对照组，差异均具有统计学意义(P均<0.05，表1)。

表1 两组尿动力学指标比较

2.3 组织学检测结果 HE染色检查可见阴部内神经切断组与对照组相比，尿道松弛、肌纤维变薄；PGP9.5免疫组化检测可见阴部内神经切断组神经标记的棕色颗粒明显减少，即组织内神经肌肉结合部密度降低、去神经化成功(见图1、图2)。

图1 阴部内神经切断组与手术对照组HE染色图(×40)

图2 阴部内神经切断组与手术对照组PGP9.5免疫组化图(×400)

3 讨 论

流行病学研究结果，女性尿失禁发病率将随着年龄的增长而升高。有调查显示：大于20岁的女性分年龄段调查，50岁为尿失禁总患病率的第一个高峰，约为30%，超过50岁后患病率会有轻微的下降；患病率第二个高峰在到70岁后，该年龄段女性的患病率会升高至35%～40%。另外调查还显示：不仅尿失禁患病率随着年龄的增加而增加，而且尿失禁病情也随着患者年龄的增大而加重。数据显示：严重性压力性尿失禁患者中， 25～44岁年龄段占比例为10%，45～59岁年龄段内为15%,60岁以上可高达33%；而急迫性尿失禁25～44岁年龄段占比例为8%，45～59岁年龄段内为18%,60岁以上可高达45%；混合性尿失禁25～44岁年龄段占比例为19%，45～59岁年龄段内为33%,60岁以上可高达53%。

在参阅相关文件的基础上，本实验对建立大鼠SUI模型的各项实验条件进行了实验，同时进行了更加深入的检测，应用目前比较权威、热门的蛋白神经产物9.5即PGP9.5进行免疫组织化学，更进一步鉴定了模型成功[7-9]，在不断的努力中确定了该建模条件。在开始的模型的选择上，本着研究SUI的发病机制和进行SUI治疗的设计观念。模型建立成功率有较大差异，比如：阴道扩张成功率为39%，阴部神经压迫成功率为46%，而阴部神经切断术成功率则可达100%[10]；阴道扩张模拟产伤模型的恢复性强，有研究表明，模拟妊娠，绝经等条件需要时间较长，并且存在一定的恢复率[11-12],神经损伤以后会缓慢的恢复，这样会导致肌肉的缓慢修复[13]；离断坐骨神经或者阴部神经的方法建模方便，周期较快， 模型制作成功率高，很少短期恢复[14]；切断阴部内神经制作模型，提高了特异性，成功率高[15]， 因此本实验依照此方法为基础，考虑再增加特异性因素，离断支配尿道括约肌的阴部内神经，同时切除约2 mm长度神经，防止神经再生，使模型的稳定性及特异性得到提高，为SUI的研究提供合格材料，从而探究其治疗方法。

检验模型成功与否模型对本实验的成败非常重要成功。最大膀胱容量和漏尿点压力检测可以侧面反映储尿功能的改变，对诊断压力性尿失禁有意义[16]。在储尿期女性对尿液的控制能力决定于尿道压，主要决定于括约肌，同时盆底和尿道周围肌肉的功能以及尿道的长短都会对尿道有影响。通常动物的储尿能力可以通过漏尿点压力和最大膀胱容量评价。在其他条件完全相同的情况下，阴部内神经切断组的最大膀胱容量和漏点压均小于手术对照组，即阴部内神经切断组的最大储尿能力小于手术对照组。提示可以认为通过双侧阴部内神经切断术，使降低了大鼠的储存尿液的能力。

实验中需要给大鼠尿道插管以方便测定大鼠的最大膀胱容量和膀胱漏尿点压力。首先我们要对雌性大鼠的尿道解剖具有熟悉的认知，在插管中要在导管上涂抹足量润滑剂以顺利插管。选择容易获得的硬膜外导管和F3水囊测压管为测压管，测压管插入大鼠直肠中，测量大鼠漏尿时的直肠压，以直肠压作为腹部漏尿点压，减少中间误差，提高了压力测定的准确性[16]。确保注射器导管内灌注和测压，在灌注中要注意缓慢匀速充盈膀胱，尽量降低将刺激膀胱挛缩。在研究过程中，外界干扰条件(如呼吸或温度等)都会影像波形图，会有大小振幅的表现，所以统计压力值时，要2次测量求平均值。结果中显示：和对照组比较实验组尿流动力学表现为膀胱最大容量减少，漏尿点压力降低，这代表尿道闭合不全，喷嚏试验阳性率增高。

模型的成功率可通过喷嚏试验的阳性率评价，有研究提出[17]： SUI动物模型常规成功率为40%～64%[18]。从本研究来看，在建模方法改进后，本研究模型成功率高达85%。整个实验中，阴部内神经组死亡大鼠3只，分别因为手术和不明原因，对照组无死亡例，总的来说模型的建立过程和结果是非常成功。

特别是实验中发现在阴部内神经切断组和手术对照组的比较中，阴部内神经切断组的PGP9.5显色明显减少，提示了PGP9.5是综合性的肌肉神经标记，这种标记可用于研究肌肉神经损伤恢复变化[19-20]。进行PGP9.5免疫组化，我们基本可以显示所有的肌肉的末梢神经。另外，在我们研究的观察时间范围内，在神经肌肉，PGP9.5显示出的手术对照组神经的数量明显高于阴部内神经切断组，这对尿道括约肌末端神经肌肉的受损后如何修复的研究有很大帮助。

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(编辑 何宏灵)

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Feasibility of establishing pudendal nerve cut rat model of female stress urinary incontinence

CHU Mao-lin, ZHANG Chun-ying, XIU You-cheng

(1.the Second Department of Urology,the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086; 2.the Third Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China)

Objective To explore the feasibility of establishing animal model of stress urinary incontinence (SUI) by bilateral transection of the pudendal nerve. Methods A total of 40 healthy female WT rats were randomly divided into two groups, bilateral pudendal nerve transection group (PNT group,n=20), and control group (n=20). Bilateral pudendal nerves were transected in the PNT group, and isolated in the control group. The sneeze test, abdominal leak point pressure (ALPP) test and histological examination were performed in all animals.Results The maximum capacity and ALPP of the PNT group were less than those of the control group. The sneeze test was positive in the PNT group while negative in control group. Both HE staining and immunohistochemistry examination were positive in the PNT group. The success rate of SUI animal model was 85%. Conclusion It is feasible and reproducible to establish rat models of SUI, but the workload is rather large. Histological examination can provide solid evidence for the successful establishment of SUI animal models.

stress urinary incontinence; animal model; abdominal leak point pressure; sneeze test; rat

2015-03-31

2015-08-25

张春影(1963-)，主任医师，博士，研究方向为原发性早泄、前列腺疾病.E-mail：zyzhanghli@sohu.com

初茂林(1983-)，男(汉族)，硕士，住院医师.研究方向为压力尿失禁、肾肿瘤.E-mail：chumaolin@163.com

R695.1

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.010.016