阿托伐他汀对兔急性心肌梗死后梗死边缘区和非梗死区瞬间外向钾电流影响的研究

张铁军 张旭妍 苗华为 菅鹏辉 李霞 董燕平 封亚丽

研究表明，急性心肌梗死后左心室心肌细胞可发生电生理异质性改变，特别是在不同部位，如梗死边缘区和非梗死区细胞之间电生理差异性更加明显，是引起恶性心律失常，从而导致心源性猝死的主要因素之一。本文拟通过全细胞膜片钳记录方法观察阿托伐他汀对急性心肌梗死后兔心肌梗死区边缘区和非梗死区单个心外膜心室肌细胞(Epicardium，Epi)进行研究，以进一步了解阿托伐他汀对心肌梗死后梗死边缘区和非梗死区细胞离子通道的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 本研究选用新西兰纯种大耳白兔30 只，以上动物均由河北医科大学实验动物中心购买，雌雄不拘，质量1.5 ～2.0 kg。随机分为3 组，每组10 只。分别为正常对照组(CON 组)，其他两组均采用结扎兔左前降支方法［1］以建立心肌梗死模型后一组为心肌梗死组(AMI 组)分离左心室心肌梗死部位梗死边缘区(AMI-R)和非梗死区(AMI-N)细胞，另一组为阿托伐他汀组，从手术日开始连续口服阿托伐他汀(5 mg·kg－1·d－1)，共7 d，后分离AMI-R 和AMI-N 细胞。阿托伐他汀由辉瑞公司生产。

1.2 血脂水平测定 以上3 组均在手术建立模型前抽取静脉血，用生化分析仪测定血清总胆固醇。

1.3 实验方法

1.3.1 液体配置:参见文献［2］中微电极电极内液成分:KCl 140，MgCl20.53，EGTA 10，HEPES 10，采用KOH 调节pH 值至7.3。电极外液:在无钙台氏液基础上，增加BaCl2用于阻断内向整流钾电流，增加氯化钴用以阻断钙电流和钙依赖性瞬间外向钾电流(Ito2)。

1.3.2 梗死区和非梗死区心室肌细胞分离:心肌梗死模型存活1 周时采用猝击兔头颅枕部方式致昏后迅速开胸切取心脏，置于4℃恒温无钙台氏液中，迅速连接在Langendorff 心脏灌流装置上，经主动脉根部逆行用无钙台氏液灌流10 min，将含Ⅰ型胶原酶、牛血清蛋白的无钙台氏液反复灌流心脏8 ～10 min，采用眼科剪仔细剪下梗死边缘区和非梗死区［2］心室肌组织:距梗死区边缘2 ～4 mm 心室壁，以眼科剪、眼科钳将心室壁横向解剖，心外膜细胞位于为紧邻心外膜侧1.0 ～1.5 mm 心肌，精确剪取并剪碎，置于稀释1 倍的酶液中搅拌，在保证氧气冲入条件下，保持恒温36℃分离细胞，静止4 ～5 min 后取细胞悬浊液可于镜下看到存活的心肌细胞，过滤并离心保存在KB 液中保存，待1 h后细胞膜恢复状态后可记录电流。

1.3.3 心室肌细胞封接与全细胞膜片钳记录模式的建立:参考文献建立全细胞记录模式后［2］，待记录微电极阻抗达2 ～3 MΩ 时，吸取已静置的心室肌细胞悬液滴于灌流槽中，待心室肌细胞沉底附壁后，灌流液充分灌流冲去酶液，镜下选取立体感强、表面光洁、横纹清晰的杆状心室肌细胞为细胞封接对象。利用三维液压微操纵器将记录微电极靠近细胞膜进行封接，给予负压吸引，待封接阻抗达1 GΩ 以上时，再采用较大负压吸破细胞膜，同时补偿电容电流和电极串联电阻，形成全细胞记录模式。通过pulse +pulsefit 软件控制脉冲信号，通道信号经EPC-9 膜片钳放大器放大，通过电极丝和微电极传导入心室肌细胞内，EPC-9 膜片钳放大器转换刺激细胞产生的电流信号后，经pulse +pulsefit 软件分析。实验过程保持室温恒定于20 ～25℃，为减少系统误差，均于细胞破膜后稳定2 min 开始记录细胞电流信号。分别记录以上3 组的Epi 心肌细胞Ito 电流。为降低细胞间误差，电流值以电流密度(pA/pF)表示。

1.3.4 Ito 的记录方法:①电流-电压曲线(I-V 曲线):首先将细胞钳制于－ 50 mV 电压，后超极化至－160 mV电压，持续50 ms，然后去极化至－40 mV 电压，使钠离子通道失活，于50 ms 后去极化脉冲从－30 mV电压跃升至+70 mV 电压，阶跃为10 mV 电压，整个时程为250 ms。将不同钳制电压下的Ito 强度绘成I-V 曲线。分别记录CON 组、AMI 组和阿托伐他汀组的I-V 曲线及钳制电压为+70 mV 时的电流，并进行组间比较。②失活曲线的电压诱导方案:先将细胞钳制在－50 mV，超极化至－ 100 mV，持续250 ms，阶跃10 mV，至－40 mV，去极化至+70 mV，持续250 ms，阶跃10 mV。将记录的Ito 与最大激活时的Ito 之比，与相应的条件脉冲膜电位作图得Ito 通道失活曲线。

1.4 统计学分析 应用SPSS 15.0 统计软件，计量资料以± s 表示，3 组间比较采用方差分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血脂测定 CON 组、AMI 组和阿托伐他汀组血清总胆固醇分别为(1.81 ±0.29)、(2.0 ±0.12)、(1.95 ±0.12)mmol/L，3 组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.2 心外膜细胞Ito 电流I-V 曲线的变化 3 组细胞电流密度于+70 mV 电压时达峰值，AMI 组较CON 组Epi 的I-V 曲线整体呈下降趋势，CON 组于+70 mV电压时Ito 电流密度为(115.8 ±6.0)pA/pF (n=15 cells)明显高于AMI 组中梗死边缘区(52.75 ±9.94)pA/pF(n =12 cells)和AMI 组非梗死区的Ito 电流密度(72.29 ±8.74)pA/pF (n =15 cells)，差异有统计学意义(P ＜0.01)。AMI 组中梗死边缘区和非梗死区心外膜电流密度之间存在差异有统计学意义(P ＜0.05)。阿托伐他汀组中梗死边缘区和非梗死区的心外膜细胞电流密度在+70 mV 电压的Ito 电流密度分别较AMI 组上升，分别为(80.27 ±2.19)pA/pF(n =13 cells)、(86.15 ±2.64)pA/pF(n=13 cells)，2 者之间比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。图3 为CON组、阿托伐他汀组梗死边缘区和非梗死区的心外膜细胞Ito 细胞电流图。见图1 ～3。

2.3 心外膜细胞Ito 电流Ito 失活曲线比较 CON 组心外膜细胞的Ito 失活曲线在－30 mV 完全失活，半数失活电压(V0.5)为(－68.46 ±7.53)mV (n =12 cells)，AMI 组梗死边缘区和非梗死区的心外膜细胞的Ito 失活曲线在－20 mV 完全失活，两者V0.5 分别为(－59.92 ±7.48)mV (n =11 cells)和(－56.55 ±9.10)mV (n =13 cells)，CON 组、AMI 组梗死边缘区和非梗死区的心外膜细胞的失活曲线趋势之间无明显变化，CON 组与AMI 组非梗死区半数失活电压比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，AMI 组梗死区和梗死边缘区的心外膜细胞的半数失活电压比较无统计学意义(P ＞0.05)。阿托伐他汀组梗死边缘区和非梗死区的心外膜细胞失活曲线均在－30 mV 完全失活，两者细胞V0.5 分别为(－64.64 ±7.53)mV (n =11 cells)和(－62.70 ±6.64)mV (n =13 cells)，差异无统计学意义(P ＞0.05)。

图1 CON 组、AMI 组梗死边缘区和非梗死区的心外膜细胞Ito 细胞电流图

图2 CON 组、AMI 组梗死边缘区和非梗死区的心外膜细胞Ito I-V 曲线

图3 CON 组、阿托伐他汀组梗死边缘区和非梗死区的心外膜细胞Ito I-V 曲线

3 讨论

研究证实，他汀类药物是羟基-3 甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)抑制剂，他汀类药物的作用除了降低血脂以外，还有非降脂作用，其中有抗心律失常作用［3］，但他汀类对于心肌梗死后抗心律失常的离子通道机制作用尚未不确切。

心肌细胞动作电位为细胞膜中多种离子通道顺序启动及关闭的整体作用的结果［4］。本研究证实，兔急性心肌梗死后左心室游离壁心外膜梗死边缘区和非梗死区Ito 电流密度存在明显差异，梗死边缘区及非梗死区Epi 细胞Ito 的失活曲线右移，失活变的缓慢，以上变化会导致左心室心肌梗死区边缘区和非梗死区心外膜动作两个不同部位的电位平台期出现不一致性，从而使心室肌细胞不同部位之间复极过程的离散度增加，梗死区边缘区和非梗死区之间存在电生理差异性增加［5］可诱发Ito 所介导的2 相折返机制从而引起室性心律失常的发生。

本研究证实阿托伐他汀能使兔急性心肌梗死边缘区和非梗死区心外膜细胞下降的Ito 密度增加，右移的稳态失活曲线左移，减轻心室肌细胞Ito 不同区域之间的电压梯度差异，缓解了梗死区边缘区和非梗死区心肌细胞与供血正常区心外膜心肌细胞之间Ito 差异所造成的电生理异质性，从而减少由Ito 所介导2 相折返的机会，从而证实阿托伐他汀改善急性心肌缺血而可能引发的折返性室性心律失常的发生。

表明阿托伐他汀降低AngⅡ、TNF-α 的表达水平，抑制心肌梗死后心室结构重构，保护受损心室肌功能，从而减轻心室肌细胞电生理异质性，达到减少室性心律失常的发生［6］。在急性心肌梗死初期尽应用阿托伐他汀缓解可缓解心室肌细胞的离子通道异常机制与他汀类药物在稳定斑块、调节血脂的基础上，通过改善血管内皮细胞功能、抑制炎性反应、缓解减少心肌梗死面积和无复流［7］作用有关。有研究表明，阿托伐他汀可通过抑制凋亡关键酶降低了心肌细胞凋亡数目［8］，同时具有改变心肌梗死后心室肌部分细胞膜离子通道的活性［9］达到抗心律失常的作用。

1 张铁军，李佃贵，张彩萍，等.化浊解毒活血方对兔心肌梗死1 周后瞬间外向钾电流跨壁异质性的影响.辽宁中医杂志，2011，3:555-556.

2 张铁军，李佃贵，张彩萍，等.黄芪对兔急性心肌梗死左室心外膜细胞瞬间外向钾电流影响的研究.河北医药，2009，31:3199-3201.

3 边波，孙跃民，万征.他汀类药的抗心律失常作用:从临床循证证据到分子机制.中国心脏起搏与心电生理杂志，2009，23:377.

4 Antzelevitch C，Dumaine R.Elenctrical heterogeneity in the heart:physiological pharmacological and clinical implication//Hand book of physiology.The Cardiorvascular System.The Heart Am Physiol Soc，2002，1:654-692.

5 Perrier E，Kerfant BG，Lalevee N，et al.Mineralocorticoid receptor antagonism prevents the electrical remodeling that precedes cellular hypertrophy aftermyocardial infarction.Circulation，2004，110:776-783.

6 吴帆，孙立强，刘宗芳，等.阿托伐他汀对大鼠心肌梗死后AngⅡ、TNF-α 及心功能的影响.实用诊断与治疗杂志，2006，20:8-10.

7 Zhao JL，Yang YJ，Cui CJ，et al.Pretreatment with simvastatin reduces myocardial no-reflow by opening mitochondrial K(ATP)channel.Br J Pharmacol，2006，149:243-249.

8 张琼，陈书艳.阿托伐他汀对大鼠心肌急性缺血细胞凋亡及caspase-3 因表达影响.中华实用诊断与治疗杂志，2010，24:965-967.

9 Tamargo J，Caballero R，Gomez R，et al.Lipid-lowering therapy with statins，a new approach to antiarrhythmic therapy.Pharmacol Ther，2007，114:107-126.