HPLC法测定陈皮水提物中三种活性成分含量

吴 霞，叶勇树，王国才，李药兰*

(1.广东药学院 中心实验室，广东 广州 510006；2.暨南大学 中药及天然药物研究所，广东 广州 510632)



HPLC法测定陈皮水提物中三种活性成分含量

吴 霞1，叶勇树2，王国才2，李药兰2*

(1.广东药学院 中心实验室，广东 广州 510006；2.暨南大学 中药及天然药物研究所，广东 广州 510632)

目的：采用高效液相色谱(HPLC)法测定陈皮水提物中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素含量。方法：采用HPLC法，以橙皮苷、川陈皮素和橘皮素为化学对照品，固定相：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm, 5μm)，流动相：乙腈和0.5%的醋酸水溶液，流速：1.0mL/min，检测波长：283nm和330nm，柱温：25℃。结果：橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的保留时间在20.46～35.55min之间，平均回收率为97.5%～98.6%，RSD为2.1%～3.3%，精密度为0.97%～1.0%；同时测定了收集自不同产地和年份的10种陈皮的活性成分含量。结论：HPLC法适合陈皮中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素含量的测定，该方法操作简便，具有较高的灵敏度和精密度。

HPLC法；陈皮水提物；活性成分

陈皮为芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮，主要分布于我国广东、四川、福建、江西等地[1]。陈皮性温，味苦、辛，具有燥湿化痰、理气健脾的功效[2]，作为药用和食用的历史悠久，其保健功效早已被国内外所认同。现代药理研究发现，陈皮水提物具有较好的药理活性作用[3-5]，其中橙皮苷和多甲氧基黄酮川陈皮素及橘皮素为其有效成分[6-9]。陈皮中所含黄酮类成分以橙皮苷的含量最高，其次是多甲氧黄酮类成分，该类成分又以川陈皮素和橘皮素的含量居高[10-11]。因此，本实验建立了HPLC法测定广陈皮水提物中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素三种有效成分含量的分析方法，同时测定了不同产地来源陈皮的有效成分含量。该方法可为陈皮在食品和药品中的进一步开发利用提供科学依据。

1 仪器与试剂

仪器：Agilent-1200 高效液相色谱系统；二极管阵列检测器(DAD)；对照品：橙皮苷、川陈皮素、橘皮素(自制，经1H-NMR、13C-NMR和MS等技术和理化性质鉴定，用HPLC峰面积归一法测定其纯度在98%以上)；试剂：乙腈(色谱纯，科密欧公司)，水为纯净水(怡宝食品饮料有限公司)，醋酸(分析纯，广州化学试剂厂)。药材：广陈皮(S1)购于江门市新会区，经暨南大学药学院周光雄教授鉴定为茶枝柑Citrusreticulate'Chachi'的干燥成熟果皮；收集不同储存时间、不同产地的陈皮样品10批，经暨南大学药学院周光雄教授鉴定为陈皮。样品保存于暨南大学药学院。具体见表1。

表1 陈皮药材(无限极有限公司提供)

2 实验方法

2.1 检测波长选择

由紫外吸收色谱图可以看出，橙皮苷在283nm处、川陈皮素和橘皮素在 330nm 处有较强吸收且基线平稳，因此选择283nm 作为橙皮苷的检测波长，330nm作为川陈皮素和橘皮素的检测波长，结果见图1。

图1 供试品溶液中橙皮苷(A)、川陈皮素(B)和橘皮素(C)紫外吸收色谱

2.2 流动相选择与优化

本实验考察了甲醇-水、乙腈-水及在流动相中添加不同浓度的乙酸对样品分离的影响。结果表明，采用乙腈-0.5%乙酸水系统对橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的分离效果与甲醇-水系统相比有明显改善，而乙酸浓度对样品分离影响不大；同时，采用梯度洗脱能满足样品基线分离且保留时间适宜。因此，实验采用乙腈-0.5%乙酸水系统作为流动相，洗脱方式为梯度洗脱。

2.3 提取方法考察

本实验主要考察广陈皮水提物中有效成分橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量。实验采用水加热回流提取法，分别考察20倍量和30倍量水、提取次数对结果的影响。结果表明，30倍量水加热回流提取三次，已接近提取完全。见表2。

2.4 色谱条件

优化后色谱条件为：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)；流动相：乙腈(B)-0.5%醋酸水(A)进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；检测波长：283nm(橙皮苷)，330nm(川陈皮素和橘皮素)；柱温：25℃；进样量：10μL，见表3。

表2 水(30倍量) 加热回流提取次数考察(峰面积)

表3 梯度洗脱条件

在上述色谱条件下，广陈皮水提物中供试品及橙皮苷、川陈皮素和橘皮素色谱峰分离度良好，结果见图2。

图2 各样品色谱

2.5 对照品溶液制备

精密称取川陈皮素1.7mg、橘皮素1.5mg，加甲醇溶解，定容，得川陈皮素(0.34mg/mL)、橘皮素(0.30mg/mL)混合液。精密称取橙皮苷2.0mg置于5mL容量瓶中，精密加入混合液1.0mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀制成每1mL含川陈皮素0.068mg、橘皮素0.06mg和橙皮苷0.4mg的混合对照品溶液。

2.6 供试品溶液制备

取广陈皮药材(S1)粉碎，过80目筛，混合均匀后，精密称定约4.0g，置于500mL 圆底烧瓶中，加120mL水，直火加热回流提取1h，放冷至约40～50℃，抽滤，重复提取3次，过滤，合并过滤液，浓缩，加水定容至250mL容量瓶中，摇匀即得。取1mL溶液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.7 标准曲线建立

分别精密吸取上述混合对照品溶液1、4、6、10、16、20μL注入液相色谱仪，按“2.4”项下色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标进行线性回归，分别得到橙皮苷标准曲线为y=1668.4x+1.061，r=0.999 9(n=6)，川陈皮素标准曲线为y=3494.5x+16.712，r=0.999 8(n=6)，橘皮素标准曲线为y=3661.2x-0.3414，r=0.999 9(n=6)。结果表明橙皮苷、川陈皮素和橘皮素分别在0.8～8.0μg、0.136～1.36μg、0.12～1.2μg范围内质量与峰面积线性关系良好。

2.8 精密度考察

精密吸取混合对照品溶液10μL，按“2.4”项下色谱条件连续进样5次，记录峰面积值，结果橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的峰面积RSD值分别为1.0%、0.96%和0.97%，表明仪器精密度良好。

2.9 稳定性考察

取广陈皮(S1)供试品溶液于制备后0、2、8、16、24h，按“2.4”项下色谱条件进样，橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的峰面积RSD值分别为2.80%、0.66%和0.80%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.10 重复性试验

精密称定广陈皮粉末(S1)约4.0 g，平行5份，分别按“2.6”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.4”项下色谱条件进行测定，记录峰面积值，结果橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的峰面积RSD分别为0.7%、1.1%和3.6%(n=5)，表明测定方法重现性良好。

2.11 加样回收率考察

精密称取广陈皮(S1)粉末4.0g，平行操作5份，分别加入一定量的对照品，按“2.6”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.4”项下色谱条件进行测定，记录峰面积值，并计算各测得含量值。结果表明，橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的平均回收率分别为97.5%、98.9%和98.6%，RSD分别为2.4%、2.1%和3.3%(n=5)，表明该方法准确度良好。结果见表4。

表4 广陈皮水提物加样回收率试验结果 (n=5)

3 含量测定

分别精密称取不同产地陈皮粉末4.0g，按照“2.6”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.4”项下色谱条件进行测定，记录峰面积值，按照线性回归方程，以1g广陈皮中所含有效成分含量(mg)计算广陈皮有效成分含量。结果见表5。

表5 不同产地不同年份陈皮有效成分含量测定结果

4 结果与讨论

本实验主要测定了陈皮水提物中三种有效成分的含量。供试品制备采用水加热回流提取的方法，能较好地将有效成分提取出来，由于橙皮苷易溶于热水，过滤时将提取液冷却置40～50℃过滤，可减少损失。提取方法具有对环境无污染，操作简便，适用于食品及药品的生产利用。

实验中考察了甲醇-水、乙腈-水及在流动相中添加不同浓度的乙酸对样品分离的影响。结果表明，采用乙腈-0.5%乙酸水系统对橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的分离效果与甲醇-水系统相比有明显改善且乙酸浓度对样品分离影响不大，同时，采用梯度洗脱能满足样品基线分离且保留时间适宜。

本实验建立了HPLC法测定广陈皮水提物中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量，同时，还对不同产地不同年份陈皮进行分析测定，该方法简便、准确高效、稳定性好，为陈皮的质量控制提供科学依据。

[1] 陈有根，范崔生.陈皮类的生药学研究[J].江西中医学院学报, 1995(S1)：26.

[2] 中国国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005：1321.

[3] 李伟，郑天珍，瞿颂义，等.陈皮对大鼠胃平滑肌条收缩活动的作用及机制的探讨[J].中国中西医结合杂志, 2000(S1)：49-50.

[4] 敬璞，丁晓雯，苏晔.柑桔皮水提液在小鼠体内的抗氧化作用研究[J].西南农业大学学报, 2003, 25 (3): 265-267.

[5] 方玉复，魏玉平，丁香安，等.陈皮对浅部真菌的试管内抑菌实验及临床疗效观察[J].中国皮肤性病学杂志, 1997, 11 (5): 275.

[6] YI ZB, YU Y,LIANG YZ.In vitro antioxidant and antimicrobial activities of the extract of Pericarpium Citri Reticulatae of a new Citrus cultivar and its main flavonoids[J].Food Science and Technology, 2008, 41 (4): 597-603.

[7] KUROWSKA EM,MANTHEY JA.Hypolipidemic effects and absorption of citrus polymethoxylated flavones in hamsters with diet-induced hypercholesterolemia[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52 (10): 2879-2886.

[8] HENG Q,HIROSE Y,YOSHIMI N，et al.Further investigation of the modifying effect of various chemopreventive agents on apop tosisand cell proliferation in human colon cancer cells[J].Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2002, 128 (10): 539-546.

[9] 欧仕益.桔皮苷的药理作用[J].中药材, 2002, 25 (7): 531-533.

[10] WANG FM，SIMON JE,AVILES IF,et al. Analysis of antioxidative phenolic compounds in artichoke[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 601-608.

[11] 吴宏伟, 雷海民, 李强, 等.高效液相色谱法测定陈皮多甲氧基黄酮部位中3种黄酮的含量[J].药物分析杂志, 2007, 27 (12): 1895-1897.

(责任编辑：魏 晓)

Determination of Three Active Constituents in the Aqueous Extract of Citrus reticulata 'Chachi' by HPLC

Wu Xia1, Ye Yongshu2, Wang Guocai2, Li Yaolan2*

(1.Central Laboratory, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;2.Institute of Traditional Chinese Medicine & Natural Products, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Objective:To establish a HPLC method for determination of hesperidin, nobiletin and tangeretin in the aqueous extract of Citrus reticulata 'Chachi'.Methods:The HPLC analysis was conducted on Agilent-1200 with C18reversed-phase column (Agilent Zorbax SB, 4.6mm×250mm, 5μm). The gradient mobile phase consisted of 0.5% acetic acid and acetonitrile, and the flow rate is 1.0mL/min. The monitoring wavelengths were 283 nm and 330 nm, respectively. The column temperature was selected to be 25℃. Results:The retention times of hesperidin, nobiletin and tangeretin were ranged from 20.46～35.55 min, the average recoveries were 97.5%～98.6%, the relative standard deviations were 2.1%～3.3%, and the precision reached 0.97%～1.0%. Besides, the contents of hesperidin, nobiletin and tangeretin in the aqueous extract of Citrus reticulata 'Chachi' collected from differents places and different storage years were measured.Conclusion:The established method in the present study was simple, convenient and practicable.

HPLC; Aqueous Extract of Citrus Reticulata 'Chachi'; Active Constituents

2014-09-11

国家自然科学基金项目(81202429)

吴霞(1980-)，女，广东药学院助理研究员，研究方向为天然药物活性成分研究与药物分析。

李药兰(1963-),女，暨南大学教授，研究方向为天然药物化学和生物活性研究。E-mail: tliyl@jun.edu.cn

R284

A

1673-2197(2015)03-0024-04

10.11954/ytctyy.201503010