玄龙止咳颗粒中有效成分含量测定

曹 蕾,杨红梅,单丽芳,宋 英

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075;2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072)



玄龙止咳颗粒中有效成分含量测定

曹 蕾1,杨红梅1,单丽芳1,宋 英2*

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075;2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072)

目的：建立HPLC法测定玄龙止咳颗粒中盐酸麻黄碱，盐酸伪麻黄碱、哈巴俄苷含量的方法。方法：盐酸麻黄碱、盐酸麻黄碱的色谱条件为:Wondasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-0.1%的磷酸(含0.1%的三乙胺)(4∶96)，流速1.0mL·min-1，温度30℃，进样量10μL，检测波长210nm；哈巴俄苷的色谱条件为： Kromasil100-5-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.03%的磷酸(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0～10min，90%～97%A；10～20min，67%～90% A；20～25min，50%～67% A；25～30min,20%～50% A，30～35min，20% A；35～37min，20%～97% A)，柱温35℃，检测波长280nm，流速1.0mL·min-1，进样量10μL。结果：盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、哈巴俄苷线性范围分别为0.164 4～1.644 0μg(r=1.0)，0.183 6～1.813 6μg(r=0.999 9)，0.204 8～2.048 0(r=0.999 9) ，平均加样回收率分别为100.56%(RSD=1.48%)，100.58%(RSD=0.63%)，99.83%(RSD=2.35%)。结论：建立的测定方法精密度高、重复性好，可用于玄龙止咳颗粒剂的质量控制，为其质量标准的建立奠定了基础。

玄龙止咳颗粒；盐酸麻黄碱；盐酸伪麻黄碱；哈巴俄苷；含量

玄龙止咳为成都中医药大学的临床经验方，由玄参、蜜麻黄、地龙、僵蚕等药味组成，全方滋阴宣肺，祛风止咳，治疗中最具特色之处是内外风兼治，滋阴祛风兼顾，疗效显著。方中玄参为君药，具有清肺、解毒消火功效最宜于肺结核、肺热咳嗽，哈巴俄苷为玄参中含量较高的成分,文献报道具有抗慢性炎症、降压、镇痛、解痉、抗乙肝病毒以及免疫促进作用[1]；蜜麻黄为臣药，增润肺之功，适宜于肺燥失宣所致的咳嗽，麻黄碱，伪麻黄碱是主要有效成分[2]，故将三者纳入检测指标。本文中建立的方法，通过方法学验证，操作简便，重复性好，为玄龙止咳颗粒的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国惠普公司) 、BP211D型电子分析天平(德国塞多利公司)；盐酸麻黄碱(批号:171241-201007)、盐酸伪麻黄碱(批号:171237-201208)、哈巴俄苷(批号:111730-201307)均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯；玄龙止咳颗粒为成都中医药大学附属医院本课题所研制(批号分别为：20150511、20150515、20150520)。

2 方法与结果

2.1 麻黄含量测定

2.1.1 色谱条件[3-5]Wondasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：以0.1%的磷酸(含0.1%的三乙胺)为流动相A，甲醇为流动相C；柱温30℃；流速：1.0mL·min-1；进样体积：10μL，检测波长210nm。

2.1.2 溶液制备 对照品溶液的制备：分别精密称定盐酸麻黄碱4.11mg、盐酸伪麻黄碱4.59mg于25mL的容量瓶中，加甲醇定容到刻度制成质量浓度为0.164 4mg·mL-1、0.183 6mg·mL-1的混合溶液，作为对照品，备用。供试品溶液的制备：本品颗粒1g，研细，置于10mL锥形中，加入10mL0.1%盐酸甲醇精密称定，超声处理1h，加0.1%盐酸甲醇补足重量，摇匀。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.1.3 专属性考察 按照“2.1.1”项下的色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液各10μL进样分析，记录色谱图。盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，并且各组分互不干扰，阴性对照在相应位置上未见色谱峰，本方法专属性良好。

2.1.4 线性关系考察 分别吸取2.1.2项下对照品溶液，1、2、3、2、10mL分别于10、10、10、5、10mL容量瓶中，分别标号1、2、3、4、5号对照品，用甲醇稀释至刻度，超声后过滤，按“2.1.1”色谱条件进样。以进样量浓度为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。盐酸麻黄碱回归方程为：Y=28 078X+12.796(r=1.0)、盐酸伪麻黄碱的回归方程为：Y=28 295X-5.616(r=0.999 9)。结果表明：盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱分别在0.164 4～1.644 0μg、0.183 6～1.813 6μg范围内线性关系良好。

图1 盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱色谱

2.1.5 精密度试验 精密吸取“2.1.4”项下2号对照品溶液10μL，连续进样测定6次，记录色谱图，测定每次进样的峰面积。结果盐酸麻黄碱，盐酸伪麻黄碱的RSD值分别为0.020%、0.094%，表明精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批玄龙止咳颗粒(批号：20150511 )2g， 共6份，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，进样10μL，测定峰面积，计算含量及相对标准偏差。结果样品中盐酸麻黄碱的平均含量为0.483 5mg·g-1，盐酸伪麻黄碱的平均含量为1.167 6mg·g-1；其含量的RSD值分别为1.32%、1.44%。结果表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 按“2.1.2”项下方法制备供试溶液(批号：20140511 )，取同一样品溶液，分别于第0、2、4、6、8、10h进样进行测定，结果盐酸伪麻黄碱、盐酸麻黄碱的RSD值分别为1.29%、1.57%，结果表明本品在10h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收试验 精密称取已知含量的样品(批号：20150511，盐酸麻黄碱的含量为0.483 5mg·g-1，盐酸伪麻黄碱的含量为1.167 6mg·g-1)1g，共6份，研细，精密加入混合对照品(盐酸麻黄碱0.164 4mg·mL-1、盐酸伪麻黄碱0.183 6mg·mL-1)4mL，按供试品溶液方法制备，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，进样10μL，测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

2.2 玄参含量测定

2.2.1 色谱条件[6-8]Kromasil100-5-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：以0.03%的磷酸为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；柱温35℃；进样体积：10μL。按表2进行梯度洗脱。

2.2.2 溶液制备 对照品溶液的制备：精密称定哈巴俄苷2.50mg于25mL的容量瓶中，加甲醇定容到刻度制成质量浓度为0.1mg·mL-1的混合溶液，作为对照品，备用。供试品溶液的制备：取本品颗粒1g，研细，置于10mL容量瓶中，加入10mL50%甲醇进行超声处理1h，加50%甲醇至刻度，摇匀。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

表1 盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱加样回收率试验结果 (n=6)

表2 梯度洗脱程序 (%)

2.2.3 专属性考察 按照“2.2.1”项下的色谱条件，分别精密吸取哈巴俄苷对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液各10μL进样分析，记录色谱,见图2。哈巴俄苷与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，并且各组分互不干扰，阴性对照在相应位置上未见色谱峰，本方法专属性良好。

2.2.4 线性关系考察 分别吸取“2.2.2”项下对照品溶液，1、2、3、2、10mL分别于10、10、10、5、10mL容量瓶中，分别标号1、2、3、4、5号对照品，用甲醇稀释至刻度，超声后过滤，按“2.2.1”项色谱条件进样。以进样量(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。哈巴俄苷回归方程为：Y=24 024X+1.718 1(r=0.999 9) 。结果表明：哈巴俄苷在0.204 8～2.402 8μg范围内线性关系良好。

图2 哈巴俄苷与玄参样品色谱

2.2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液10μL，连续进样测定6次，记录色谱图，测定每次进样的峰面积。结果哈巴俄苷的RSD值为0.10%，表明精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批玄龙止咳颗粒剂(批号：20150511 )1g， 共6份，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，进样10μL，测定峰面积，计算含量及相对标准偏差。结果样品中哈巴俄苷的平均含量为0.3170 mg·g-1，其含量的RSD值为2.11%。结果表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 按“2.2.2”项下方法制备供试溶液(批号：20140511 )，取同一样品溶液，分别于第0、2、4、6、8、10h进样进行测定，哈巴俄苷的RSD值分别为0.664%，结果表明本品在10h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收试验 精密称取已知含量的样品(批号：20150511，哈巴俄苷的的含量为0.3170 mg·g-1)1g，共6份，精密加入哈巴俄苷对照品溶液(0.1 mg·mL-1)3mL，按供试品溶液的制备方法制备，进样10μL，测定峰面积，计算回收率，结果见表3。

表3 哈巴俄苷加样回收率实验结果

由实验结果可得：哈巴俄苷的平均回收率为99.83%，RSD值为2.35%；表明该方法的加样回收率较好，该方法的准确度较好。

2.3 样品测定

取3批玄龙止咳颗粒样品，每批3份，精密称取样品2g，按麻黄和玄参供试品溶液的制备方法制备。分别精密吸取各自的对照品溶液和样品溶液各10μL，按各自色谱条件分别测定，计算3批样品中盐酸麻黄碱平均质量分数分别为0.483 5、0.475 7、0.491 2mg·g-1，RSD为1.60%；盐酸伪麻黄碱为1.167 6、1.160 9、1.169 5mg·g-1，RSD为0.39%；哈巴俄苷为0.317 0、0.319 8、0.314 3mg·g-1，RSD为0.87%，表明该方法适合玄龙止咳颗粒中有效成分的含量测定。

3 讨论

麻黄中麻黄碱和伪麻黄碱均为苯丙胺类生物碱，采用的对照品是盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱，故在考察稀释剂时，除了考察常规的甲醇、乙腈以及药典中记载的1.44%的磷酸之外，还考察了1%的盐酸甲醇。对比前三者，使用盐酸甲醇的峰形更好，而且测出来的含量要偏高一些，有可能是1%的盐酸甲醇使得盐酸麻黄碱和伪麻黄碱更好的游离而易于被检测到。

玄参中主要指标性成分，除了哈巴俄苷之外还有哈巴苷。试验中也试图考察哈巴苷的含量，但是在玄参阴性图谱中，哈巴苷的位置有干扰，故仅将哈巴俄苷纳入指标。

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[2] 李佳莲,方磊,张永清,等.麻黄的化学成分和药理活性的研究进展[J].中国现代中药,2012,14(7)：21-27.

[3] 叶莎,李兴华,任欣欣.HPLC法测定复脉灵胶囊中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量[J].中国药师,2013,16(6)：841-843.

[4] 吴曼.HPLC法测定咳喘平合剂中盐酸麻黄碱、伪麻黄碱的含量[J].海峡药学,2012,24(4)：48-50.

[5] 陆燕萍,刘佳丽,巩晓宇.麻黄药理作用及含量测定的研究进展[J].中国医药导报,2013,10(24)：38-40.

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(责任编辑：余 婷)

Determination of Effective Components in the XuanLong Cough Granule

Cao Lei1,Yang Hongmei1,Shan Lifang1,Song Yng2*

(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine(TCM) ,Chengdu 610075,China; 2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610072,China)

Objective:To establish an HPLC method for determining ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride,harpagosides in XuanLong cough granule.Methods:HPLC conditions of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride were as follows :C18column (250mm×4.6mm，5μm),mobile phase was methanol-0.1% phosphate (including 0.1% of triethylamine) (4∶96),flow rate 1.0mL·min-1,column temperature 30 ℃,injection volume 10μL,detection wavelength 210nm;and conditions of harpagosides were:Kromasil 100-5-C18column (250mm×4.6mm,5μm),the mobile phase was 0.03% phosphate (A)-acetonitrile (B) with gradient elution program (0～10min,97～90%A;10～20min,90～67%A; 20～25min,67～50%A;25～30min,50～20%A,30～35min,20%A; 35～37min,20～97%A),column temperature 35℃,detection wavelength 280nm,flow rate 1.0mL·min-1,injection volume 10μL.Results:linear ranges of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride,harpagosides were 0.164 4～1.644μg (r=1.0),0.183 6～1.813 6μg (r=0.999 9), 0.204 8～2.048μg(r=0.999 9) ,the average recoveries of them were 100.56% (RSD=1.48%),100.58 (RSD=0.63%),99.83 (RSD=2.35%).Conclusion:the established determination method was high precision and good reproducible,which can be used in the quality control of XuanLong cough granules,and laid the foundation to establish its quality standard.

XuanLong Cough Granules; Ephedrine Hydrochloride; Pseudoephedrine Hydrochloride;Harpagosides；Content

2015-07-21

四川省科技厅项目(CKY2014007)

曹蕾(1989-)，女，成都中医药大学硕士研究生，研究方向为中药制剂。

宋英(1959-)，男，成都中医药大学附属医院主任中药师，研究方向为中药学。E-mail：806380106@qq.com

R284.2

A

1673-2197(2015)23-0031-04

10.11954/ytctyy.201523012