不同方法提取双黄二仙水提液中黄芪甲苷实验研究

杨红梅,曹 蕾,单丽芳,宋 英,涂 翔,钟 森

(1.成都中医药大学,四川 成都 610075;2.成都中医药大学附属医院,四川 成都 610072)



不同方法提取双黄二仙水提液中黄芪甲苷实验研究

杨红梅1,曹 蕾1,单丽芳1,宋 英2*,涂 翔2,钟 森2

(1.成都中医药大学,四川 成都 610075;2.成都中医药大学附属医院,四川 成都 610072)

目的：比较不同提取方法对双黄二仙颗粒水提液黄芪甲苷提取效果的影响,建立双黄二仙药液中黄芪甲苷含量测定方法。方法：分别采用超声法、大孔树脂法和水饱和正丁醇-氨试液萃取法提取药液中黄芪甲苷，使用HPLC-ELSD法测定其含量。结果：测定了3种提取方法下的黄芪甲苷的含量,建立了以水饱和正丁醇-氨试液的提取为该制剂提取黄芪甲苷的含量测方法。结论：该方法准确、灵敏、重现性好,专属性强,为该制剂质量标准的制定奠定了基础。

黄芪甲苷;提取工艺;含量测定

双黄二仙颗粒是由黄芪、沙苑子等 7 味药材经提取、浓缩、加工而制成的制剂，具有益气摄精、补肾降蛋白的功效。黄芪为方中要药，其所含的成分主要为黄芪甲苷等皂苷类成分及毛蕊异黄酮等黄酮类成分[1]，且黄芪甲苷等皂苷为本方的主要药效成分，为了更好地控制双黄二仙颗粒的质量,需对方中君药黄芪进行定量检测。黄芪甲苷含量高、性质稳定，故以黄芪甲苷作为该制剂的指标。本研究采用HPLC-ELSD法对双黄二仙颗粒中黄芪甲苷的含量进行测定[2]。

1 材料

1.1 仪器

电子天平(十万分之一)BP-211D 赛多利斯科学仪器(中国)有限公司；HZT-A+200型电子天平福州华志科学仪器有限公司；高效液相色谱仪HP-1260惠普公司。

1.2 试剂试药

黄芪甲苷(中国食品药品检定研究院),纯度为95.8%，批号:110781-201314。黄芪饮片(生产批号：1411015)，四川新荷花中药饮片有限公司。

2 方法与结果

2.1 药液中黄芪甲苷的提取

精密吸取本品药液25mL，加水稀释至50mL，用60mL水饱和的正丁醇振摇提取4次，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤正丁醇液2次，每次60mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水10mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，以水50mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。

精密吸取本品药液25mL，加水稀释至50mL，用水饱和正丁醇提4次，每次60mL，合并正丁醇液，氨试液洗2次，每次60mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

精密吸取本品药液25mL，加水稀释至50mL,加氨试液10mL,振摇充分,再加入正丁醇60mL,密塞,超声处理(功率600W,33kHz)15min,静置分层,倾出上层正丁醇液,下层再加入正丁醇60mL,同法再处理1次,合并2次正丁醇液,滤过,滤液用水洗涤2次,每次60mL,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得[3]。

精密吸取本品药液25mL，加水稀释至50mL,加入正丁醇60mL,密塞,超声处理(功率600W,33kHz)15min,静置分层,倾出上层正丁醇液,下层再加入正丁醇60mL,同法再处理1次,合并2次正丁醇液,滤过,滤液用水洗涤2次,每次60mL,弃去水液,再用氨试液10mL洗涤，正丁醇液蒸干,残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2 对照品溶液制备

精密称取黄芪甲苷对照品4.27mg，置25mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(0.170 8mg/mL)。

2.3 供试品溶液制备

精密量取上述样品溶液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液作为供试品溶液。

3 样品含量测定

3.1 色谱条件

色谱柱：菲罗门Phenomenex ODS(5μm，4.6mm×150mm)；流动相：以A∶B(35∶65)为流动相 [A为乙腈；B为高纯水]；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；检测器：蒸发光检测器[4]。

3.2 专属性考察

以处方比例，取缺黄芪药材的其他饮片，按本制剂制备工艺制得缺黄芪阴性药液。按“3.1”项HPLC-ELSD条件进行试验,比较阴性溶液、对照溶液与供试品溶液的HPLC-ELSD图谱，如图1所示。

图1 黄芪阴性样品和对照品、供试品溶液的液相色谱

结果显示，在黄芪甲苷峰位处无吸收，空白无干扰,样品和黄芪甲苷对照品在相应的主峰位置上有相应的色谱峰,且分离度较好。

3.3 线性关系考察

精密称取黄芪甲苷对照品3.76mg，置20mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。另精密吸取上述对照品2、6、8、10、12μL按“3.1”项下方法使用蒸发光测定，以进样量对数(lgx)为横坐标，以峰面积对数(lgy)为纵坐标，得回归方程:y=1.774 5x+3.062 2，r=0.999 8。结果显示，黄芪甲苷进样量在0.376 5～2.259 0μg 范围内线性关系良好。

3.4 含量测定

精密吸取上述3种供试品溶液，按“3.1”项下方法，对照品分别进样2μL、10μL，样品进样10μL，测得各自峰面积，以外标两点法计算黄芪甲苷的含量，如表3所示。

表3 提取方法的筛选 (n=3)

结果：提取方法1所测定的含量较方法2、3高，但方法1的提取过于繁琐复杂，不利于操作，方法2简便且测得含量较高，适宜实际操作，故将方法2作为本制剂的提取方法。

3.5 精密度考察

取本品10mL,按“2.1”项下方法，在同一实验室，考察仪器的精密度，进样 10μL，连续进样6 次，测得峰面积，计算含量。测得RSD值为1.59%，结果显示，精密度良好。

3.6 稳定性考察

取本品10mL，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于放置后的 0、2、4、8h使用蒸发光测定，进样10μL。结果显示RSD值为1.97%，本品供试品溶液在8h内检测稳定性较好，该方法稳定可行。

3.7 重复性

取本品10mL，称取6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，进样，测定。结果显示药液中黄芪甲苷含量平均值为0.031 4mg/mL，RSD值为1.97%，本方法的重复性较好。

3.8 加样回收

精密称量黄芪甲苷对照品3.15mg，置20mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(0.157 5mg/mL)。取已知含量的样品药液5mL(0.031 5mg/mL)，共6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液(0.157 5mg/mL)1mL，按供试品方法制备样品。按照上述色谱条件，精密吸取供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，采用外标两点法计算黄芪甲苷的含量。计算回收率：黄芪甲苷的平均回收率为101.03%，回收率在95%～105%，RSD=0.94%,表明该方法的加样回收率较好，该方法的准确度较好。

4 讨论

考查不同的流动相对本品的影响。按照2010版药典，测黄芪甲苷的流动相为乙腈-水(32∶68) ，保留时间约15.5min，基线较平，但连用蒸发光散射检测器时，对照品峰面积波动非常大，不适合用来计算样品含量，故将流动相调至乙腈-水(35∶65)，效果良好， 同时考查漂移管温度、载气流速对本品的影响。结果显示，漂移管温度为102℃ 时，基线较好，峰分离好; 载气流速为2.6mL/min时，峰状态较好。

[1] 朱燕辉，严丰祥.黄芪甲苷及其生物学活性[J].现代生物医学进展，2008，8(4):781-783.

[2] 彭全材,胡继伟,杨占南，等.HPLC测定贵州产黄芪中黄芪甲苷的含量[J].江西师范大学学报，2007,31(7)：278-281.

[3] 胡琨.HPLC测定芪肾口服液中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量[J].南京中医药大学学报,2014,30(2):195-196.

[4] 雷健，胡雪莲，金一南，等.高效液相色谱-蒸发光散射法测定益生胶囊中黄芪甲苷含量[J].中国药业，2011,21(16):47-48.

(责任编辑：余 婷)

Study on different extraction methods of Shuanghuang Erxian aqueous extract of Astragaloside

Yang Hongmei1,Cao Lei1,Shan Lifang1,Song Ying2*,Xu Xiang2,Zhong Sen2

(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine(TCM) ,Chengdu 610075, China; 2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610072,China)

Objective:To compare the effect of different extraction methods on the extraction of Radix astragalus of Shuanghuang Erxian aqueous extract.To establish a method for determination the astragaloside of Shuanghuang Erxian liquid.Methods:Using ultrasonic method,macroporous resin method and water saturated butanol-ammonia solution extraction liquid of Astragaloside,HPLC-ELSD method was used to determine its content.Results:Determination the content of Astragalus with three extraction methods,A method for the extract of Astragalus by water saturated butanol was established.Conclusion:The method is accurate,sensitive,reproducible and specific,which lays the foundation for the formulation of the quality standard of the preparation.

Astragalus;Extraction;Content Determination

2015-08-05

四川省中医药管理局青年基金(2014K108)；成都市科技局科技惠民应用示范项目(2014-HM02-00014-SF)；成都中医药大学附属医院科技发展基金(2013-D-YY-14)

杨红梅(1989-)，女，成都中医药大学硕士研究生，研究方向为中药药剂学。

宋英(1959-)，男，成都中医药大学附属医院主任中药师，研究方向为中药学。E-mail：806380106@qq.com

R284.2

A

1673-2197(2015)23-0035-02

10.11954/ytctyy.201523013