不同粉体三、四妙丸HPLC指纹图谱对比研究

肖 娟，蔡 萍，万 丹，张水寒

(湖南省中医药研究院 湖南省中药粉体与创新药物省部共建重点实验室，湖南 长沙 410006)



不同粉体三、四妙丸HPLC指纹图谱对比研究

肖 娟，蔡 萍，万 丹，张水寒*

(湖南省中医药研究院 湖南省中药粉体与创新药物省部共建重点实验室，湖南 长沙 410006)

目的：分别建立超微粉和细粉三妙丸和四妙丸的HPLC指纹图谱，并进行对比研究。方法：用HPLC色谱法，对不同粉体形态的妙丸建立指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”建立标准指纹图谱，对不同粉体形态各妙丸的指纹图谱进行相似度分析。结果：方法的重复性及稳定性良好。两种不同粉体形态的妙丸指纹图谱的相似度均大于0.90，两者在共有峰上没明显差别，而峰面积有差别。结论：该方法稳定准确，建立的HPLC指纹图谱，能从整体上反映出三妙丸和四妙丸的化学成分信息，为建立质量标准提供了参考依据。

妙丸；HPLC 指纹图谱；超微粉

二妙丸、三妙丸和四妙丸均是收载于2010版《中国药典》的经典名方，广泛用于治疗湿热痰痹引起的各种湿热浸淫疾患[1-3]。三妙丸、四妙丸都是从二妙丸演变而来，三妙丸中多了一味化瘀通络、补肝强肾、引药下行的牛膝；四妙丸中薏苡仁能利湿舒筋，故主治下焦湿热之痹证、痿证[4-5]。与传统粉碎技术相比，超微粉碎技术可将中药材粉碎成微米级甚至纳米级，显著提高了药材细胞壁的破碎率，粒径大小分布更均匀，表面积增加，利于有效成分的溶出、释放与吸收，提高生物利用度[6]。有文献报道[7]超微粉妙丸功效明显优于细粉丸。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段, 通过指纹特征相似程度的比较, 可达到判断药材及成药的真伪、优劣、质量的稳定性和一致性,也已经成功用于中成药生产过程中[8]。本研究通过建立细粉和超微粉三妙丸和四妙丸HPLC指纹图谱，以探索HPLC指纹图谱能否全面反映出化学成分信息以及不同粉体间存在的差异，为制定质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BFM-T6BI“贝利”微粉机(济南贝利粉碎技术工程有限公司)；Winner3001 干粉激光粒径仪(济南微纳仪器有限公司)；柴田式粉碎机(天津市渤海鑫茂制药设备有限公司)；可倾式多功能制丸机(DZ-20,温岭市林大机械有限公司)； 高效液相色谱仪 (SHIMADZ-LC-20A，日本岛津)；色谱柱：Inertsil ODS-2(GL Sciences Inc，250mm×4.6mm,5μm)；T-214电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 试剂

甲醇(色谱级)，甲醇(分析纯)，醋酸(色谱级), 怡宝蒸馏水。

盐酸小檗碱对照品(批号：110713-200208，中国食品药品检定研究院)。

1.3 材料

细粉和超微粉三妙丸和四妙丸均为实验室自制，经检验符合药典要求。

细粉妙丸制剂工艺：取处方比例的药材，混合采用柴田式粉碎机粉碎，过5号筛，得细粉，混匀，在可倾式多功能制丸机中用水泛丸，70℃干燥，灭菌即得。

超微粉妙丸最佳制剂工艺：取处方比例的药材混合，采用贝利粉碎机粉碎，粉碎最佳参数是药材干燥至水分7%以下，介质填充率60%～70%，振幅为5mm，粉碎温度1～15℃，粉碎时间25min,采用Winner3001 干粉激光粒径仪测得粉体粒径的D90<90μm(90%粒径值)，得超微粉混匀，在可倾式多功能制丸机中用水泛丸，70℃干燥，灭菌即得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为: Inertsil ODS-2(GL Sciences Inc，250mm×4.6mm,5μm)

三秒丸：流动相为: A为1%的醋酸水溶液，B为1%的醋酸甲醇溶液；梯度洗脱：0～10min： 2%～5% B，10～15min 5%～15% B，15～25min 15%～25% B，25～45min 25%～55% B，45～65min 55%～85% B。

检测波长:254nm，柱温: 35℃，流速:1.0mL·min-1，进样量:10μL。

四妙丸：流动相为: A为水溶液，B为甲醇；梯度洗脱：0～45min 10%～45% B，45～65min 45%～85% B。

检测波长:280nm，柱温: 30℃，流速:1.0mL·min-1，进样量: 10μL。

2.2 对照品溶液制备

取盐酸小檗碱适量，精密称定，置于10mL的量瓶中，加甲醇制成浓度为0.1mg·mL-1的对照品溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，备用。

2.3 供试品制备

取10批细粉三妙丸适量，研细，取粉末6.0g，精密称定，至于索氏提取器中，精密加入乙醚100mL，35℃水浴回流5h，弃去乙醚液，残渣挥去乙醚加95%乙醇60mL,回流提取1h，过滤；残渣加50%乙醇60mL，回流提取2次过滤，合并提取液，浓缩至20mL，用60%乙醇定容至25mL，摇匀，作为供试液，进样前用0.45μm微孔滤膜滤过，得细粉三妙丸供试品。

取10批超微粉三妙丸适量，研细，取粉末6.0g，精密称定，得超微粉三妙丸供试品。

取10批细粉四妙丸适量，研细，取粉末6.0g，精密称定，得细粉四妙丸供试品。

取10批超微粉四妙丸适量，研细，取粉末6.0g，精密称定，得超微粉四妙丸供试品。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样5次,记录指纹图谱，以参照峰为对照峰计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果RSD<2.0%,相似度均大于0.95，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μL, 按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8h测定,记录指纹图谱，以参照峰为对照峰计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果RSD<2.0%,相似度均大于0.93，符合指纹图谱要求，表明8h内样品稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取超微粉三妙丸同一批次样品5份,按“2.3.1”项下供试品溶液制备条件操作制备供试品溶液,进样分析，记录指纹图谱，以参照峰为对照峰计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果RSD<2.0%,相似度均大于0.94，符合指纹图谱要求，表明方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立及分析

2.5.1 参照峰的选择 由于黄柏中盐酸小檗碱的含量高，且保留时间恰当，也是质量控制的指标成分，故选用盐酸小檗碱作为参照峰。按“2.1”项下三妙丸的色谱条件进样，记录色谱，见图1。

图1 盐酸小檗碱对照品液相色谱

2.5.2 指纹图谱数据的采集 分别取不同粉体三妙丸和四妙丸的供试品，按照“2.1”项下的妙丸的色谱条件方法分别得到细粉和超微粉妙丸的指纹图谱，均以盐酸小檗碱为参照峰，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004 A版)分别对妙丸的共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积进行统计。

2.5.3 共有峰的标定 对10批样品的图谱分析比较，计算各妙丸中不同批次供试品色谱图中共有峰占总面积的百分比，结果表明共有峰面积占总面积90%以上，符合指纹图谱的要求。

2.5.4 指纹图谱共有模式的建立及相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004 A版)分别对三妙丸和四妙丸进行相似度分析，以三妙丸为例，以盐酸小檗碱峰为参比峰,以S4为参照图谱，经过多点校正、自动匹配，采用中位数法生成对照图谱(图2)，标示了细分和超微粉三妙丸指纹图谱中15个共有峰,其中11号峰为盐酸小檗碱峰；同理得到四妙丸中共有峰15个，见图3、图4、图5、图6。

图2 三妙丸典型的HPLC指纹图谱

2.5.5 相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004 A版)进行相似度分析，不同粉体三妙丸和四妙丸之间HPLC指纹图谱的相似度均大于0.91，细粉和超微粉四妙丸之间的相似度大于0.90，符合指纹图谱要求。

本实验建立的指纹图谱可以从整体上反映出三妙丸和四妙丸化学成分信息，为质量标准提供参考；从指纹图谱的共有峰来看，不同粉体没有显著差别，但在共有峰面积上，超微粉妙丸的峰面积要大于细粉妙丸(见表3、表4，S1/S2>1)，说明药材经超微粉碎后，粉末均匀，粒径减小但表面积增大，与提取溶媒的接触面积增加，相同的提取时间内提取效率提高，有效成分溶出量增加，生物利用度提高，在保证药效的基础上，可在一定程度上减少给药剂量，提高效率。

3 讨论

各妙丸检测波长的选择都是通过HPLC-DAD检测, 在色谱条件下,绘出三维色谱图, 选择色谱峰信息完整,分离度好, 基线平稳,干扰最少的波长。采用单因素法对各妙丸的提取方法进行考察，回流提取效率更高，且乙醚除去苍术中的挥发油使得色谱峰的分离度更好，检测信号更平稳，确定采用“2.3”项的提取方法。

图3 10批超微粉三妙丸的HPLC指纹图谱

图4 10批细粉三妙丸的HPLC指纹图谱

图5 10批超微粉四妙丸的HPLC指纹图谱

图6 10批细粉四妙丸的HPLC指纹图谱

峰号S1S2S1/S2峰号S1S2S1/S219811659344731．059173886816609091．0524503594597791．02106962646625751．0538243667595531．091190416247869255941．0444704754373081．08125631165316601．0659743668982991．081311872848113481301．0565098434867241．051414359716182271．057240000122895371．051512274819354021．0488426197813031．08

表4 不同批次细粉、超微四妙丸共有峰峰面积均值及相应比值

注：S1是10批超微粉妙丸各共有峰峰面积均值;S2为10批细粉妙丸各共有峰峰面积均值。

由于薏苡仁和牛膝的紫外吸收特征较弱，在方剂配伍中用量较少，建立的指纹图谱中两者的特征峰不明显。此外，还需要对指纹图谱中色谱峰进行对应药材的归属。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010:454-646.

[2] 梁汝庆, 郑桂芝，孔祥亮. 二妙散到四妙丸的用药规律初探[J].中医药学刊,2004,22(12):2337-2338.

[3] 李祥，赵亮，吕磊，等. 三妙丸及其组方药材的化学成分、质量控制及临床应用[J].药学服务与研究，2013,13(4):274-277.

[4] 尹莲, 史欣德.四妙丸加味治疗急性痛风性关节炎概述[J].中国中医药科技, 2004,11(1):63-65.

[5] 金万勤, 黄芳, 郭立玮. 苍术、黄柏及二妙丸超细微粉的生物药剂学的研究Ⅰ．扫描电子显微镜技术对超细微粉的表征[J].中草药,2001,32(4):306-308.

[6] 袁清照，张水寒，蔡光先. 超微粉碎技术在枳术丸中的应用及溶出影响研究 [J].中国实验方剂学杂志，2009,15(9):10-13.

[7] 黄芳，郭立玮，袁红宇，等. 超细粉体技术对二妙丸体内吸收、分布的影响[J].南京中医药大学学报：自然科学版,2007,18(4):216-218.

[8] 白瑞，王真真.指纹图谱在中药质量控制中的应用进展[J].安徽医药,2009,13(12):1458-1462.

(责任编辑：余 婷)

HPLC Fingerprint Study on Ultro-micro and Nomlal powder of San and Si Miao Pill

Xiao Juan, Cai Ping, Wan Dan, Zhang Shuihan*

(Hunan Acadamy of Chinese Medicine Hunan Chinese Medicine Powder and Innovation Drug Province Department Coconstruction and Key Laboratories, Ministry of Education,Changsha 410006,China)

Objective:To establish HPLC fingerprint of Ultro-micro and Nomlal powder of San and Si Miao Pill respectively and compare the fingerprints.Methods:To establish HPLC fingerprint of Ultro-micro and Nomlal powder of Miao Wan. The HPLC chromatograms were analyzed by the the “traditional Chinese medicine fingerprint similarity calculation software”.Results:The results of methodological study met technical requirements of HPLC fingerprint. The similarities of the Ultro-micro and Nomlal Miao Wan exceeded 0.90, The HPLC fingerprints of Ultro-micro and Nomlal Miao Wan had obvious differences in area of common peaks but less differences in number of common peaks.Conclusion:The HPLC fingerprint method was stable and accurate and could show the whole chemical composition information and provide a basis for the establishment of quality standard for Miao pill.

San and Si Miao Pill；HPLC fingerprint；Ultro-micro Powder

2015-07-10

湖南省战略性新兴产业科技攻关与重大科技成果转化项目(2012GK4103)

肖娟(1978-)，女，湖南省中医药研究院实验师，研究方向为中药制剂。

张水寒(1960-)，女，博士，湖南省中医药研究院博士生导师，研究方向为中药资源、制剂及质量标准。E-mail：zhangshuihan0220@126.com

R284.1

A

1673-2197(2015)23-0027-04

10.11954/ytctyy.201523011