微波辅助萃取法提取玄参中哈巴苷和哈巴俄苷的工艺研究

傅 亚，范 佳，陈 芳，杨荣萍，张景勍，姚 波*

1 重庆科技学院，重庆 401331;2 重庆中药研究院，重庆 400065;3 重庆医科大学药学院，重庆 400016

中药玄参(Figwort Root，Radix Scrophulariae)为玄参科植物玄参(Scrophularia ningpoensis Hemsl)的干燥根，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效［1］。天然药物化学研究发现，玄参主要含有环烯醚萜类、苯丙素苷、糖类、肉桂酸、皂苷等［2，3］。近年对其主要化学成分环烯醚萜类研究较多，哈巴苷与哈巴俄苷是环烯醚萜苷类中两个主要的成分［4，5］，经研究发现，这两种成分具有抗慢性炎症、降压、镇痛以及免疫促进的作用，因此将哈巴苷与哈巴俄苷作为玄参的特征性成分［6，7］。

微波辅助萃取技术是近年来发展迅速的中药有效成分提取技术，与传统的中药活性成分提取技术相比，具有简便、快速高效、选择性强、能耗少和环境污染小等优点［8］，已广泛应用于黄酮、多糖和生物碱等有效成分的提取［9］。

本研究设计单因素实验和正交实验，利用微波辅助萃取法提取玄参中的哈巴苷与哈巴俄苷，采用HPLC 测定哈巴苷和哈巴俄苷的含量，通过对乙醇浓度、料液比、微波温度、微波时间和微波功率因素的考察，筛选出微波提取玄参中哈巴苷与哈巴俄苷的最佳工艺条件。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

玄参(采自重庆南川玄参GAP 基地);哈巴苷(四川，成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-13121902，纯度≥98%)及哈巴俄苷(四川，成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-11071801，纯度≥98%);乙腈、甲醇(HPLC Grade，Honeywell Burdick ＆ Jackson);乙醇、磷酸(AR，Honeywell Burdick ＆Jackson)。

1.2 仪器

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司);X101 型微波催化合成/萃取仪(北京详鹄科技有限公司);旋转蒸发仪RE-2000A(上海亚荣生化仪器厂);DZF-6020 真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司);BosChrom ODS 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);KH-250 型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);DZF-6020 真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司);SHZ-95B 循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);FA2104B 电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 原料预处理

玄参根块50 ℃干燥后，粉碎，过70 目筛，备用。

2.2 哈巴苷和哈巴俄苷的测定

哈巴苷和哈巴俄苷的HPLC 测定方法参照中国药典2010 版［10］，色谱柱:BosChrom ODS(250mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:乙腈(A)-0.03%磷酸(B)，梯度洗脱:0～10 min，3%～10%(A);10～20 min，10%～33%(A);20～25 min，33%～50%(A);25～30 min，50%～80%(A);30～35 min，80%(A);35～37 min，80%～3%(A)，流速:1.0 mL/min，检测波长:210 nm，进样量:20 μL，柱温为常温。

2.3 玄参哈巴苷和哈巴俄苷的微波提取工艺

将玄参药材清洗除杂，晾干，粉碎，取已粉碎玄参药材5.0 g，加入一定量的溶剂作为萃取剂，在控制设置条件下，微波萃取，抽滤，恒温干燥，温度控制在60 ℃左右，取干燥样品约0.5 g，精密加入50%甲醇50 mL 密封，备用。

2.4 单因素实验

2.4.1 乙醇浓度对玄参哈巴苷和哈巴俄苷提取率的影响

称取玄参粉末约5 g，微波辅助提取玄参中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波功率为600 W、提取时间为35 min、料液比为1∶20、微波温度为50 ℃的条件下，分别选择不同浓度的乙醇0、20%、40%、60%、80%进行单因素试验，得到哈巴苷、哈巴俄苷和总苷的提取率。

2.4.2 料液比对玄参哈巴苷和哈巴俄苷提取率的影响

称取玄参粉末约5 g，微波辅助提取玄参中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波功率为600 W、提取时间为35 min、乙醇浓度为40%、微波温度为50 ℃的条件下，分别选择不同的料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 进行单因素试验，得到哈巴苷、哈巴俄苷和总苷的提取率。

2.4.3 微波温度对玄参哈巴苷与哈巴俄苷提取率的影响

称取玄参粉末约5 g，微波辅助提取玄参中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波功率为600 W、料液比为1∶20、乙醇浓度为40%、提取时间35 min 的条件下，分别选择不同的微波温度为30、40、50、60、70 ℃进行单因素试验，得到哈巴苷、哈巴俄苷和总苷的提取率。

2.4.4 微波时间对玄参哈巴苷与哈巴俄苷提取率的影响

称取玄参粉末约5 g，微波辅助提取玄参中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波温度为50 ℃、料液比为1∶20、乙醇浓度为40%、微波功率为600 W 的条件下，分别选择不同的微波时间20、25、30、35、40 min进行单因素试验，得到哈巴苷、哈巴俄苷和总苷的提取率。

2.4.5 微波功率对玄参哈巴苷与哈巴俄苷提取率的影响

称取玄参粉末约5 g，微波辅助提取玄参中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波温度为50 ℃、料液比为1∶20、乙醇浓度为40%、提取时间35 min 的条件下，分别选择不同的微波功率为500、600、700、800、900 W 进行单因素试验，得到哈巴苷、哈巴俄苷和总苷的提取率。

2.5 正交实验

在上述单因素实验基础上，采用L9(34)正交实验进一步分析乙醇浓度、微波温度、微波功率、微波时间对玄参哈巴苷和哈巴俄苷总提取率的影响，优化哈巴苷和哈巴俄苷的微波提取工艺。表1 为优化实验因素及因素所取水平。

2.6 玄参提取率的计算

根据标准工作曲线，按下式分别求出哈巴苷与哈巴俄苷浓度、提取率及总提取率:

表1 优化实验因素及因素所取水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

式中:C1-哈巴苷的浓度，μg/mL;C2-哈巴俄苷的浓度，μg/mL;A1-哈巴苷的峰面积，mv;A2-哈巴俄苷的峰面积，mv;P1-哈巴苷的提取率，%;P2-哈巴俄苷的提取率，%;P3-哈巴苷和哈巴俄苷的总提取率，%;m-玄参提取液的干燥物质量，g;m1-用于测定的干燥物质量，g;M-玄参药材的质量，g。

3 实验结果

3.1 样品中哈巴苷和哈巴俄苷的HPLC 测定

取不同浓度的哈巴苷与哈巴俄苷对照品进样，记录高效液相色谱图中哈巴苷与哈巴俄苷的峰面积(见图1A)，建立哈巴苷和哈巴俄苷的标准曲线和回归方程:哈巴苷线性回归方程:Y=5899.6X+6618.1，R2=0.9998;哈巴俄苷线性回归方程:Y=28559X+11410，R2=0.9997。哈巴苷与哈巴俄苷分别在15～240 μg/mL 和5～80 μg/mL 范围内具有良好的线性关系。

取哈巴苷与哈巴俄苷对照品，分别连续进样5 次进行精密度测定，分别计算平均峰面积，算出相对标准偏差，结果哈巴苷的RSD 为1.07%，哈巴俄苷的RSD为0.94%，都低于2%，表明该仪器的精密度良好。

取5 份已知样品浓度的提取液0.5 mL，将已知浓度的哈巴苷与哈巴俄苷混合对照品分别按0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 分别加入到5 份样品中，定溶在10 mL 的容量瓶中进行回收率实验，得到峰面积，换算浓度，计算回收率，得到哈巴苷的平均回收率为99.10%，RSD 为1.80%;哈巴俄苷的平均回收率为98.20%，RSD 为1.70%。

图1 混合标准品(A)、玄参样品(B)的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A)and Radix Scrophulariae sample(B)

3.2 单因素实验

3.2.1 乙醇浓度对玄参哈巴苷和哈巴俄苷提取率的影响

实验结果显示(见图2A):当溶剂为纯水时玄参哈巴苷的提取率最高，哈巴俄苷的提取率最低，在其他实验条件不变的情况下，随着乙醇浓度的增大，哈巴苷的提取率降低，哈巴俄苷的提取率升高。因为，一方面乙醇浓度的变化会使溶剂的极性发生改变，使得哈巴苷和哈巴俄苷及玄参中其他成分的溶出率随之改变，之所以哈巴俄苷提取率仍然在升高，可能是哈巴俄苷的极性较小;另一方面可以直接观察到玄参提取液呈黑色，可能因为该色素在乙醇中的溶出很大，抑制了哈巴苷的溶出，但是哈巴俄苷未受影响。由于总苷的提取率是在溶剂为纯水时最高，所以选择纯水做溶剂较宜。

3.2.2 料液比对玄参哈巴苷和哈巴俄苷提取率的影响

实验结果表明(见图2B):在其他实验条件不变的情况下，随着料液比的增加，测得玄参哈巴苷及哈巴俄苷的提取率均升高，且均在料液比1∶20 后随料液比升高提取率无明显变化。这是因为刚开始料液比小时，随着料液比增大，两相浓度差增大，传质速度加快的较为明显，即玄参提取率增加幅度大。继续增大料液比，但传质动力增加不大，所以提取率增加不明显，考虑节约成本，所以选择相对较小的料液比1∶20 更合理。

3.2.3 微波温度对玄参哈巴苷与哈巴俄苷提取率的影响

实验结果可知(见图2C):在其他实验条件不变的情况下，随着温度的增大，测得玄参哈巴苷及哈巴俄苷的提取率均升高，当温度为50 ℃达到最高，继续增大温度总提取率反而降低。这是由于温度有助于传质过程，使分子扩散运动更激烈，加快溶质的扩散和溶剂的渗透，但随着温度升高，杂质溶解速度也显著加快，与哈巴苷和哈巴俄苷形成竞争，干扰其浸出速率，导致哈巴苷和哈巴俄苷的提取率降低。因此微波温度选择50 ℃为宜。

3.2.4 微波时间对玄参哈巴苷与哈巴俄苷提取率的影响

实验结果表明(见图2D):在其他实验条件不变的情况下，随着微波提取时间延长，测得玄参哈巴苷和哈巴俄苷的提取率升高，哈巴苷的提取率在30 min 时达到最高，哈巴俄苷的提取率在25 min 时达到最高，继续延长提取时间总提取率反而降低。这是由于微波时间越长，对细胞膜的破坏作用越大，溶出的哈巴苷和哈巴俄苷越多，但是过于延长微波提取时间，一方面，细胞膜的破坏程度过大，其他杂质的溶出也会增加，抑制哈巴苷及哈巴俄苷的溶出;另一方面，辐射时间过长可能导致有效成分被破坏，因而提取率降低。又由于总苷的提取率在30 min 时最高，因此微波时间选择30 min 为宜。

3.2.5 微波功率对玄参哈巴苷与哈巴俄苷提取率的影响

实验结果显示(见图2E):在其他实验条件不变的情况下，随着功率的增大，玄参哈巴苷及哈巴俄苷的提取率均升高，当在600 W 的时候达到最高，继续增大功率总提取率反而降低。分析原因，因为微波功率越大时，物料吸收的微波能越多，细胞破坏程度越大，哈巴苷及哈巴俄苷溶出越多。但微波功率过大，一方面更多的易于被溶剂吸附的物质溶出，降低了哈巴苷及哈巴俄溶出率;另一方面，功率过高易使溶剂暴沸，促使溶剂挥发，降低哈巴苷和哈巴俄苷的提取率。因此微波功率选择600 W 为宜。

图2 乙醇浓度(A)、料液比(B)、温度(C)、时间(D)、功率(E)对提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration(A)，solid-liquid ratio(B)，temperature(C)，microwave time(D)and microwave power(E)on extraction yield

3.3 玄参哈巴苷和哈巴俄苷提取优化实验研究

通过设计L9(34)正交实验发现，影响玄参哈巴苷和哈巴俄苷总提取率因素的主次顺序为微波温度＞微波功率＞乙醇浓度＞微波时间，最佳水平为A1B2C2D2，即最优提取工艺参数为微波温度50℃，微波功率为600 W，乙醇浓度0%，微波时间30 min，料液比1∶20。在此最佳工艺条件下玄参哈巴苷和哈巴俄苷的总提取率为1.1172%。

表2 正交方案设计及结果Table 2 Orthogonal experiment design and result

3.4 微波辅助提取法与直接加热水提法的比较

以微波辅助提取最佳条件与直接加热水提法进行比较，结果如表3。

表3 微波辅助提取法与传统水提法结果对比Table 3 Comparison of microwave-assisted extraction method with traditional water extraction method

由上述结果可见，微波辅助提取法与直接水提法相比，具有缩短提取时间，提高哈巴苷和哈巴俄苷总提取效率的明显优势。

4 结论

由单因素及正交实验考察可知，微波提取玄参哈巴苷和哈巴俄苷的最佳提取工艺条件为:纯水提取、微波温度50 ℃，微波功率为600 W，微波时间30 min，料液比1∶20。此工艺条件下玄参哈巴苷和哈巴俄苷的总提取率为1.1172%。微波辅助提取法比直接水提法更加省时，提取率更高。

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