消银1号对5%普萘洛尔诱导的豚鼠银屑病样模型的病理改变及IL-17A、IL-18的影响

李 钦，刘海刚，祁 燕，叶建州△

(1.云南中医学院，云南 昆明 650011；2.云南省中医医院，云南 昆明 650021)



消银1号对5%普萘洛尔诱导的豚鼠银屑病样模型的病理改变及IL-17A、IL-18的影响

李 钦1，刘海刚1，祁 燕2，叶建州2△

(1.云南中医学院，云南 昆明 650011；2.云南省中医医院，云南 昆明 650021)

目的 探讨消银1号治疗银屑病的机制。方法 使用5%普萘洛尔乳膏外涂豚鼠耳部皮肤，复制银屑病样动物模型，48只豚鼠随机分为消银1号低、中、高剂量组，消银颗粒组，模型组，空白组，按照既定药量进行灌胃。分别观察复制模型1、2、3 周及治疗2周后豚鼠的一般情况及双耳病理切片Baker法评分及炎症细胞计数，检测各组豚鼠耳组织中IL-17A、IL-18表达情况。结果 消银1号能改善豚鼠银屑病样模型的精神状态、饮食等一般情况及红肿、鳞屑等类银屑病样外观；能降低病变组织Baker评分及炎症细胞计数，其高、中剂量与消银颗粒组相比有统计学意义(P<0.05)。消银1号能降低豚鼠银屑病样模型局部皮损中IL-17A、IL-18的表达，其高、中剂量与消银颗粒组相比有统计学意义(P<0.05)。结论 消银1号能降低普萘洛尔诱导的豚鼠银屑病样模型的组织中IL-17A、IL-18的表达水平。通过降低细胞因子IL-17A、IL-18的表达来调节Th17及Th1细胞的免疫应答，可能是消银1号治疗寻常型银屑病作用机理之一。

银屑病；消银1号；豚鼠银屑病模型；病理改变；IL-17A；IL-18

中医将银屑病(psoriasis)称之为“干癣、白壳疮、风癣、白疕”等，是一种临床常见的慢性炎症性和增殖性皮肤病。银屑病的发病机制尚未明确。中国传统医学对银屑病的认识及治疗经验极为丰富，近年来主要是从血热、血燥、血瘀等几个方面进行辨证论治，中医具有治疗方法多样、用药灵活、毒副作用小、疗效显著、禁忌症少、复发率低等特点。消银1号方来源于金起凤教授经验总结，经由导师叶建州主任医师根据云南地域特色及多年临床经验拟定。本实验拟通过研究消银1号对5%普萘洛尔诱导的豚鼠银屑病样模型的病理改变及IL-17A、IL-18的影响，来探讨该方治疗银屑病的可能机制。

1 材料及方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 4～5 周龄普通健康成年豚鼠，体重 300～350 g，雌雄不限。许可证号：Scxk(川)2008-24；合格证号：0002861。

1.1.2 实验药物 消银1号(水牛角、金银花、蒲公英、生地、赤芍、紫草、生地榆、生槐花、苦参、昆明山海棠)流浸膏[1-2]，所有药物均由云南省中医医院药房提供。消银颗粒(3.5 g×10包，陕西康惠制药股份有限公司生产，国药准字Z0000019)。0.9%氯化钠注射液，国药准字H52020069，250 mL/瓶；贵州天地药业有限责任公司出品，批号A13061504。

1.1.3 试剂 5%盐酸普萘洛尔乳膏由云南中医医院制剂科制作。IL-17A、IL-18试剂盒(美国R&B进口分装)。

1.1.4 仪器设备 低温高速离心机(美国 Thermo Scientific)、石蜡切片机(Leica RM2235 型)、光学显微镜(德国，DFC310FX)、超低温冰箱(美国 Thermo)、蒸发仪(EYEL4QSB-2100)。

1.2 实验方法

1.2.1 预实验 12只豚鼠分2组，即空白、模型，每组6只。模型组按照文献法[3]，使用 5%普萘洛尔乳剂(云南省中医医院制剂室配制)均匀涂于双侧耳背，面积1 cm2，厚度1 mm。1 日 4 次，共 3 周；空白组涂以 5%普萘洛尔乳剂相同的基质，用法同前。预实验目的是验证复制豚鼠银屑病模型是否成功。

①一般情况：分别观察造模 1、2、3 周后，豚鼠的精神、反应、毛发光泽度、饮食、二便、体重等情况变化。造模组动物出现：精神差，反应迟钝，喜静，进食量减少，体重下降，毛色变暗、易脱。

②豚鼠双耳形态：分别观察造模 1、2、3 周后，豚鼠双耳毛发有无脱落、局部皮肤有无红肿、皮温是否增高、表面有无银白色鳞屑，豚鼠对刺激部位有无搔抓动作等情况变化。所有造模动物耳部涂药处出现：毛发逐渐脱落，局部皮肤红肿，皮温升高，表面覆有薄层银白色鳞屑，豚鼠对刺激部位有搔抓动作。2～3 周后红肿加重，鳞屑脱落明显，刮之有出血(见下图)。

③通过切片观察病理改变。参照Baker 评分法[4]。方差分析结果表明空白组和模型组的 Baker 评分和中性粒细胞浸润数之间具有显著差异(P<0.05)，综合前二项指标判定模型复制成功(见下图)。

1.2.2 动物分组、复制模型 新进的豚鼠48只饲养一周，雌雄分开，待其状态良好，适应饲养室环境后开始实验。随机分为 6 组：消银1号低、中、高剂量组，消银颗粒组，模型组，空白组，每组8只。除空白组豚鼠外，其余6组都用 5%普萘洛尔乳膏均匀涂于双侧耳背，面积1 cm2，厚度 1 mm。1日4次，共3周[4]；空白组涂以相同的基质，用法同前。

1.2.3 给药 复制模型成功后，开始分组给药。所有组别按照豚鼠体重每100 g灌胃药总量0.5 mL配制，低剂量组剂量：3.85 g生药/kg；中剂量组剂量：7.75 g生药/kg；高剂量组剂量：15.5 g生药/kg；消银颗粒组：0.8 g/kg；空白组和模型组按照豚鼠体重灌服同等体积的生理盐水。1 日1 次，共 2 周。每隔 3天量体重 1 次，调整给药量。

1.2.4 取材及材料初处理 治疗 2 周后取材。具体方法为：10%水合氯醛麻醉数分钟，即取双侧耳组织。右侧耳组织用 10%甲醛溶液固定。左侧耳组织置于﹣80℃冰箱保存，待组织匀浆后进行 IL-17、IL-18检测。

1.2.5 指标检测 a.一般情况：具体参照预实验。b.豚鼠双耳形态：具体参照预实验。c.普通病理制片 HE 染色：将用 10%甲醛溶液固定的耳廓皮肤标本，用水浸泡，多次更换水，2h 后脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，中性树胶封片，在光学显微镜下观察病理改变，每组豚鼠双侧耳组织各作切片 2张，用光镜在 10×20 视野下观察并摄图(通过血球记数盘校正图片的面积)，分别随机选取 5 个视野，对选中视野进行 Baker 法评分[3]及炎症细胞计数。

d检测各组豚鼠耳组织中IL-17、IL-18表达情况。切取留存标本200 g，放入有1 mL预冷生理盐水的玻璃匀浆管内，手工匀浆20 min，匀浆后以3500 r/min离心15 min，吸取上清液，采用ELISA法(酶联免疫吸附测定法)检测豚鼠耳组织中IL-17、IL-18含量，操作过程按试剂盒说明书进行。

3 统计学处理

4 结果

4.1 一般情况 除空白组外所有动物出现：精神差，反应迟钝，喜静，进食量减少，体重下降，毛色变暗、易脱。经治疗 2 周后给药组上述症状不同程度减轻。

4.2 豚鼠双耳形态 出空白组外耳部涂药处出现：毛发逐渐脱落，局部皮肤红肿，皮温升高，表面覆有薄层银白色鳞屑，豚鼠对刺激部位有搔抓动作。2～3 周后红肿加重，鳞屑脱落明显，刮之有出血(详见附图)。治疗用药 2 周后，模型组变化不明显，其它各给药组症状不同程度发生变化明显。

4.3 病理组织Baker 法评分及炎症细胞计数比较 见表1、表2。

表1 各组Baker法评分

注：经Kruskal-Wallis H秩和检验分析：6组间比较，P=0.004<0.05，说明六组间有显著性差异；再经Mann-Whitney U秩和检验进行比较：与模型组比：**P=0.000<<0.01；消1中组与消1高组比，P=0.071>0.05；与消1中组比较：▲▲P=0.000<0.01；消银颗粒组与消1低组比较，P=1.71>0.05.

表2 各组炎症细胞计数

注：经Kruskal-Wallis H秩和检验分析：6组间比较，P=0.004<0.05，说明6组间有显著性差异；再经Mann-Whitney U秩和检验进行比较：与模型组比较：**P=0.000<0.01；消1中组与消1高组比较，P=0.053>0.05；消1低组与消1中组比较，P=0.073>0.05；消银颗粒组与消1低组比较，P=0.620>0.05。

4.4 豚鼠银屑病模型耳组织匀浆后IL-17A、IL-18含量结果 见表3、4。

表3 耳组织IL-17A含量测定

注：经Kruskal-Wallis H秩和检验分析：6组间比较，P=0.000<0.05，说明6组间有显著性差异；再经Mann-Whitney U秩和检验进行比较：与模型组比较：**P=0.000<0.01；消1中组与消1高组比较，P=0.535>0.05；与消1中组比较：▲▲P=0.001<0.01；消银颗粒组与消1低组比较，P=0.318>0.05。

表4 耳组织IL-18含量测定

注：经Kruskal-Wallis H秩和检验分析：6组间比较，P=0.000<0.05，说明6组间有显著性差异；再经Mann-Whitney U秩和检验进行比较：与模型组比较：**P=0.000<0.01；消1中组与消1高组比较，P=0.353>0.05；与消1中组比较：▲▲P=0.001<0.01；消银颗粒组与消1低组比较，P=0.710>0.05。

5 讨论

目前认为，银屑病是多基因遗传背景下T细胞失常的免疫性疾病[5]。皮肤组织病理中浸润的T淋巴细胞在其发病中扮演了重要的角色。T淋巴细胞针对不同抗原，分泌各种细胞因子，经过相应免疫反应，最终导致角质形成细胞增殖、角化不全、表皮突延长、颗粒层消失、炎症浸润及微血管形成。IL-17是Th17细胞分泌的一种前炎症细胞因子，可促使机体产生趋化因子，促使单核细胞、中性粒细胞大量增殖，诱导皮肤角质形成细胞产生多种抗菌肽及细胞因子，增强局部炎症。在自身免疫性疾病和炎症性疾病中，Th17细胞通过分泌IL-17、IL-22、IL-6等炎症因子介导免疫损伤，其中IL-17是Th17细胞的标志性细胞因子[6-7]。在银屑病患者的皮损处和外周血中均发现有Th17细胞的存在，且随着病情活动IL-17mRNA的表达水平会增高[8]。IL-17A作为其代表性成员，常被认为等同于IL-17，因其临床检测灵敏度最高而成为了该家族中研究最为深入的成员。IL-18属炎症前细胞因子，主要由巨噬细胞T、B淋巴细胞及树突状细胞产生。可以促进Thl细胞增殖和分化，刺激Thl细胞产生IFN-γ。增强NK细胞的杀伤活性，表现为Thl型免疫反应，同时在一定条件下，又能促进Th2型免疫反应，对多种免疫活性细胞有着直接或间接的调节功能，在系统性或局部炎症中起重要作用。IL-18在寻常性银屑病的起病及其慢性炎症反应过程中发挥重要作用。寻常性银屑病患者皮损及血清中IL-18明显高于正常人[9]。提示来源于角质形成细胞的IL-18参与了寻常性银屑病局部的Thl免疫反应。已有实验发现寻常性银屑病患者外周血中IL-17及IL-18的表达明显要高于正常健康人群，且进展期表达明显要高于静止期，IL-17及IL-18在寻常性银屑病患者外周血中的表达与PSAI评分也呈正相关[10]。

消银1号由水牛角、金银花、蒲公英、生地、赤芍、紫草、生地榆、生槐花、苦参、昆明山海棠组成，来源于金起凤教授经验总结，经由导师某教授根据云南地域特色及多年临床经验拟定。综合全方，有清热凉血活血、解毒止痒退疹之功。经现代药理研究发现，该方诸多药物合用，共有抗炎、抗过敏、降低毛细血管通透性、抑制表皮细胞增殖、抗肿瘤和免疫调节等功能。

消银1号能改善豚鼠银屑病模型的精神状态、饮食等一般情况及红肿、鳞屑、瘙痒等类银屑病样外观；能明显降低普萘洛尔诱导的豚鼠银屑病样模型的组织Baker评分及炎症细胞计数，能改善该模型的组织病理学形态；能降低5%普萘洛尔诱导的豚鼠银屑病样模型的组织中IL-17A、IL-18的表达水平。通过实验研究，我们考虑通过降低细胞因子IL-17A、IL-18的表达来调节Th17及Th1细胞的免疫应答，可能是消银1号治疗寻常型银屑病血热证作用机理之一。

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Pathological Changes of 5% Propranolol Induced Guinea Pig Model and Effect of IL-17A and IL-18 Caused byXiaoyinNo. 1

LI Qin1, LIU Hai-gang1, QI Yan2, YE Jian-zhou2

(1.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,Yunnan;2.YunnanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,Yunnan)

Objective: To study the mechanism ofXiaoyinNo. 1 in the treatment of psoriasis. Methods: 5% propranolol cream was used to coat ear skin of guinea pigs to copy psoriasis-like animal model. 48 guinea pigs were randomly divided into low, medium and high dose groups ofXiaoyinNo. 1, aXiaoyingranule group, a model group and a control group and were given intragastric administration in accordance with established dose. The copy model guinea pigs were observed in the 1st, 2nd and 3rd week and after a 2-week treatment, the general conditions, ears pathological section Baker score and inflammatory cell counts were observed and IL-17A and IL-18 presentation of guinea pigs ear tissue of each group were detected. Results:XiaoyinNo. 1 could improve the mental state and diet of the psoriasis guinea pigs as well as their redness, scaling and other types of psoriasis-like appearance and reduced Baker score and inflammatory cell counts. The medium and high dose groups were statistically significant (P<0.05) when compared withXiaoyingranule group.XiaoyinNo. 1 could reduce the IL-17A and IL-18 presentation in the local lesions of the psoriasis guinea pigs and the medium and high dose groups were statistically significant (P<0.05) when compared withXiaoyingranule group. Conclusions:XiaoyinNo.1 can reduce the IL-17A and IL-18 presentation of the propranolol-induced psoriasis-like guinea pigs. By decreasing the presentation of IL-17A and IL-18 cytokines to regulate Th17 and Th1 cells in the immune response, it may be one of mechanisms ofXiaoyinNo. 1 to cure psoriasis vulgaris.

psoriasis,XiaoyinNo.1, psoriasis guinea pig model, pathology, IL-17A, IL-18

李钦(1987～)，女，湖北，研究方向：皮肤病的防治研究，E-mail：510429151@ qq.com

△通信作者：叶建州，E-mail：kmyjz63@sina.com.

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1007-2349(2015)09-0049-04

2015-07-06)