消银汤对银屑病样模型小鼠TNF-α及IL-10的影响*

2018-02-07宋红霞薛晓东

西部中医药 2018年1期

宋红霞，薛晓东

1重庆三峡医药高等专科学校药理教研室，重庆万州 404000；2重庆三峡医药高等专科学校附属医院皮肤科

银屑病是一种常见易复发的慢性炎症性皮肤病，目前该病病因不明，近年来多认为是一种T细胞介导的自身免疫性疾病［1］。消银汤源自笔者导师多年临床经验方，后根据自身临床体会加减而成。为进一步证实其疗效及作用机制，现采用消银汤干预银屑病小鼠动物模型，并检测小鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)的水平，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物昆明种雌性小鼠60只，SPF级，体质量18～22 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SYXK(渝)2012-0001；小鼠在温度16～26℃，相对湿度40%～70%的实验环境下饲养。

1.2 药物消银汤药物组成：黄芩10 g，生地黄15 g，牡丹皮 12 g，赤芍 15 g，半枝莲 30 g，白花蛇舌草 15g，槐花 10g，紫草 10g，玄参 15g，丹参 15g，鸡血藤15 g，甘草6 g。制备方法：称取各药材，用水煎煮2次，煎出液合并，浓缩到每剂药168 mL。消银汤的人体推荐摄入量为每天168 g生药，相当于2.8 g/(kg·d)生药(成人以60 kg计)。

1.3 主要试剂及设备甲氨蝶呤片(上海信谊药业有限公司，批号：20130403)；秋水仙碱注射液(吉林省辉南辉发制药股份有限公司，批号：20130915)；己烯雌酚注射液(上海通用药业股份有限公司，批号：130203)；小鼠 TNF-α及 IL-10 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号：201310)；光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；LP-400型酶标仪(法国巴斯德公司)。

1.4 消银汤对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响［2-4］取昆明种雌性小鼠60只，随机选取10只作为空白对照组，其余每只小鼠腹腔注射0.2 mg己烯雌酚，1次/d，连续注射3天，使小鼠处于雌激素期。3天后隔天腹腔注射己烯雌酚(0.2mg/只)，至实验结束。第4天将模型小鼠随机分为5组，每组10只，即模型组及甲氨蝶呤组(2 mg/kg，相当于临床等效剂量，用生理盐水配制成所需浓度)，消银汤高(69.0 g/kg)、中(34.5 g/kg，相当于临床等效剂量)、低(17.3 g/kg)剂量组，各组灌胃给药，每天2次，连续14天，给药容积为35 mL/kg。空白对照组和模型组给予等容积的生理盐水。末次给药2小时后，每只小鼠腹腔注射秋水仙碱2 mg/kg，使细胞有丝分裂周期停滞于有丝分裂中期，便于计数。6小时后摘小鼠眼球取血，室温静置15分钟，3 000 r/min离心15分钟后分离血清，置于-70℃保存，用于TNF-α，IL-10的浓度测定。处死小鼠后，切取阴道组织，用10%甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，HE染色，光镜下观察有丝分裂情况，计数300个基底细胞中的有丝分裂数，折算出有丝分裂指数(即每100个基底细胞中的有丝分裂数)。比较各组小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂指数，并作统计学处理。

1.5 ELISA法检测血清TN F-α，IL-10 从-70℃冰箱取出各组血清样本，恢复至室温，按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行数据处理和统计分析，计量资料以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 消银汤对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响消银汤高、中、低剂量对小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂有明显的抑制作用，与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，且呈良好的量效关系。甲氨蝶呤也能明显抑制小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂(P＜0.01)。消银汤中、低剂量对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的抑制作用与甲氨喋呤相近(P＞0.05)，消银汤高剂量对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的抑制作用较甲氨喋呤强(P＜0.05)，见表1。

表1 各组小鼠阴道上皮细胞有丝分裂情况(±s)

注：*表示与模型组比较，P＜0.01；#表示与甲氨蝶呤组比较，P＜0.05

组别只数剂量/(g·kg-1) 有丝分裂指数空白对照组 10 - 10.47±2.31*模型组 10 - 19.81±3.15消银汤高剂量组 10 69.0 12.79±1.34*#消银汤中剂量组 10 34.5 15.33±2.19*消银汤低剂量组 10 17.3 16.00±2.92*甲氨蝶呤组 10 0.002 15.06±2.00*

2.2 消银汤对小鼠血清TN F-α或IL-10含量的影响与空白对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α的含量明显升高(P＜0.01)，IL-10的含量明显降低(P＜0.01)；与模型组相比，消银汤高、中剂量组小鼠血清中 TNF-α的含量明显降低(P＜0.01)，IL-10的含量均有升高(P＜0.05)，见表2。

表2 消银汤对小鼠血清TN F-α、IL-10含量的影响(±s)

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，#表示P＜0.01；与甲氨蝶呤组比较，○表示P＜0.05，△表示 P＜0.01

组别只数剂量/(g·kg-1) TN F-α/(ng·m L-1) IL-10(ng·m L-1)空白对照组 10 - 1.64±0.84# 7.30±1.58#模型组 10 - 3.80±0.77 3.35±1.79消银汤高剂量组 10 69.0 1.96±0.66#△ 6.72±2.18#消银汤中剂量组 10 34.5 2.27±0.49#○ 5.63±2.08*消银汤低剂量组 10 17.3 3.09±0.76 3.51±1.48○甲氨蝶呤组 10 0.002 3.20±1.18 5.31±1.98

3 讨论

银屑病俗称“牛皮癣”，是一种以红斑鳞屑为主的慢性炎症性皮肤病，特征性损害为红色丘疹或斑块上覆有多层银白色鳞屑［5-7］。本病病程较长，病因和发病机制复杂。目前银屑病发病机制主要有遗传因素、感染因素、免疫因素、神经精神因素、内分泌因素等［8］。近年有研究［9］表明银屑病存在着免疫异常，而细胞因子作为免疫调节的物质基础在银屑病的发病中起重要作用。TNF-α是一种与银屑病免疫炎症反应密切相关的细胞因子，它不仅能够诱导皮肤内黏附因子表达而促进淋巴细胞的浸润，而且能够促进朗格汉斯细胞的成熟，增强其活化T细胞的能力［10］。IL-10是一种较强的抗炎因子，研究发现IL-10可使银屑病表皮厚度变薄，抑制角质形成细胞过度增殖和分化［11］。IL-10在IL-4辅助下可激活Th 2型细胞并抑制Th1型细胞功能，在IL-10相对或绝对缺乏的情况下会导致银屑病的发生［12］。

雌激素期的小鼠阴道上皮细胞增殖活跃，有丝分裂增加，并且上皮细胞转换加快，可以模拟银屑病表皮增殖过快的特点，通过比较小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂指数较好地评价药物抑制细胞有丝分裂的作用［13］。该模型被作为筛选抗银屑病药物的常用模型［14］。

本实验通过建立小鼠阴道上皮模型，随后给予不同剂量的消银汤进行干预，考察消银汤对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂及血清细胞因子TNF-α、IL-10的影响。结果显示消银汤各剂量组均可明显抑制银屑病样小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂，高、中剂量可明显降低TNF-α的含量，升高IL-10的水平，提示消银汤对银屑病小鼠具有的治疗作用可能与其抑制表皮细胞增殖并降低血清中TNF-α水平，升高IL-10水平有关。

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