KYBNZ-1I对Tca8113 细胞增殖的抑制作用

常 悦，王维嘉，朴军颜，姚 珂，左非非，徐少博，徐 霞#

1)郑州大学口腔医学院正畸科 郑州 450052 2)郑州大学临床医学系 郑州 450001 3)郑州大学药学院 郑州 450001

KYBNZ-1I对Tca8113 细胞增殖的抑制作用

常 悦1)，王维嘉2)，朴军颜3)，姚 珂3)，左非非3)，徐少博3)，徐 霞3)#

1)郑州大学口腔医学院正畸科 郑州 450052 2)郑州大学临床医学系 郑州 450001 3)郑州大学药学院 郑州 450001

#通信作者，女，1965年4月生，博士研究生，教授，研究方向：药物代谢，E-mail：xuxia@zzu.edu.cn

KYBNZ-1I；Tca8113细胞；增殖；凋亡；细胞周期

目的：观察冬凌草提取物KYBNZ-1I对口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113增殖的抑制作用，并探讨其可能机制。方法：采用MTT法检测0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的KYBNZ-1I分别作用24、48、72 h对Tca8113细胞增殖的抑制作用。分别采用流式细胞仪及Western blot检测0.0、1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用48 h Tca8113细胞的周期分布、凋亡情况及CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白的表达。结果：KYBNZ-1I对Tca8113细胞增殖有抑制作用，该作用呈剂量和时间依赖性(F剂量=133.991，F时间=22.526，P<0.05)。与对照组比较，1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用48 h后G2/M期细胞增多，并可诱导细胞凋亡，呈剂量依赖性(F=108.465、212.353，P<0.05)；随药物剂量的升高，CyclinD1蛋白的表达水平下降(F=45.288，P<0.001)，CyclinB1、Cdc-2蛋白的表达水平升高(F=21.273、19.228，P<0.05)。结论：KYBNZ-1I对Tca8113细胞增殖有抑制作用，可将细胞阻滞于G2/M期并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与KYBNZ-1I抑制CyclinD1蛋白的表达、提高CyclinB1和Cdc-2蛋白的表达有关。

口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤，其中口腔鳞状细胞癌占口腔恶性肿瘤的80%以上，并且呈逐年增加的趋势[1]。近年来癌症的治疗获得了较大的进步和发展，但死亡率仍呈上升趋势。口腔鳞状细胞癌的治疗一般以手术治疗为主，放疗、化疗、免疫治疗和中医药治疗为辅。手术治疗属于损伤性治疗，而放疗和化疗不仅杀伤肿瘤细胞，对正常细胞也有破坏作用。目前传统的口腔鳞状细胞癌化疗药物如顺铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶等不良反应重、耐药广泛，而且疗效不太稳定。因此，人们正在寻找既能使化疗药物发挥最大限度的杀伤作用又不损伤正常细胞的药物[2-3]。冬凌草学名碎米桠，别名冰凌草，是一种多年生草本植物,主要产地为河南济源太行山、王屋山一带[4]。相关研究[5]表明冬凌草有抗肿瘤作用。KYBNZ-1I是新研制的一种冬凌草提取物的衍生物。作者观察了KYBNZ-1I对口腔鳞状细胞癌细胞株Tca8113的抑制作用，探讨其远期用于口腔鳞状细胞癌治疗的可能性与安全性，以期为口腔鳞状细胞癌的治疗带来新的契机。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂及仪器 Tca8113 细胞株(Type Culture Collection，美国)；KYBNZ-1I(郑州大学药学院)，胎牛血清(FBS)(北京索来宝有限公司)，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国Sigma公司)，兔抗人细胞周期蛋白(Cyclin)D1、CyclinB1、Cdc-2、β-actin多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，PBS粉末(郑州创生生物工程有限公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；CO2培养箱(E191)(美国SIM公司)，超低温冰箱(-80 ℃)(美国Thermo公司)，高速冷冻离心机(Z323K)(德国HERMLE公司)，96孔板(美国Corning Costar公司)，台式离心机(TGL-16G)(上海安亭科学仪器厂)，蛋白电泳转印仪、化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养 将Tca8113细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,置37 ℃、湿度100%、体积分数5%CO2的培养箱内进行传代培养，每 1～2 d换液 1 次。

1.3 不同剂量KYBNZ-1I处理后细胞增殖抑制率的测定 取对数生长期的Tca8113细胞，调整细胞密度为 5×104mL-1，接种于96孔板, 每孔200 μL。待细胞贴壁后分别加入终质量浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的KYBNZ-1I溶液，设5个平行复孔，然后将培养板置于37 ℃恒温培养箱中进行常规培养。分别于药物作用24、48、72 h后，加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min使结晶充分溶解，酶标仪测定570 nm波长处的OD值，细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。采用改良寇氏法计算IC50。实验重复3次。

1.4 不同剂量KYBNZ-1I处理后细胞周期的检测

取对数生长期的Tca8113细胞，以终质量浓度为1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I溶液和溶剂处理48 h；PBS洗涤2次，收集细胞，用体积分数为70%的冷乙醇固定，4 ℃保存过夜；弃去乙醇，再次悬浮细胞于PBS，溴化丙啶染色5 min，4 ℃避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期，得出细胞周期分布图。实验重复3次。

1.5 不同剂量KYBNZ-1I处理后细胞凋亡的检测

Tca8113细胞同1.4中分组、处理48 h后，用胰蛋白酶消化，收集106个细胞, PBS洗涤后加入500 mL的Binding Buffer悬浮细胞，每管加入 2 μL Annexin Ⅴ-FITC、2 μL PI双染，室温避光反应10 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据。采用5×3析因设计的方差分析观察不同剂量KYBNZ-1I分别作用24、48和72 h对细胞增殖抑制率的影响，采用单因素方差分析比较各组细胞周期分布、凋亡率及CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白表达水平的差异，两两比较采用Bonferroni法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同剂量KYBNZ-1I对Tca8113细胞增殖的影响 见表1。KYBNZ-1I处理Tca8113细胞24、48和72 h的IC50分别为5.137、4.254和6.384 mg/L。

表1 不同剂量KYBNZ-1I处理后Tca8113细胞的增殖抑制率 %

F时间=22.526，F剂量=133.991，F交互=8.083，P均<0.001。

2.2 不同剂量KYBNZ-1I对Tca8113细胞周期的影响 不同剂量的KYBNZ-1I作用48 h后, G0/G1期的Tca8113细胞减少，而G2/M期的Tca8113细胞增多。见表2。

表2 不同剂量KYBNZ-1I对Tca8113细胞周期的影响 %

*:与0.0 mg/L组相比，P<0.05。

2.3 不同剂量KYBNZ-1I对Tca8113 细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示KYBNZ-1I可以促进Tca8113 细胞凋亡，细胞凋亡率随给药剂量的增大呈上升的趋势(表3)，且晚期凋亡细胞增加尤为明显。

2.4 不同剂量KYBNZ-1I对Tca8113 细胞CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白表达水平的影响 随着药物剂量的增加，CyclinD1蛋白的表达水平逐渐下降，而CyclinB1、Cdc-2蛋白的表达水平逐渐升高，见表3。

表3 不同剂量KYBNZ-1I对Tca8113细胞3种蛋白表达水平及细胞凋亡的影响

3 讨论

口腔鳞状细胞癌是口腔系统高发的恶性肿瘤之一，该类患者临床上生存率较低， 且预后也较差。肿瘤的发生与细胞增殖及凋亡失衡有关，通过诱导肿瘤细胞凋亡来消除肿瘤已成为治疗肿瘤的有效途径。冬凌草衍生物已被证实不仅具有抗肿瘤作用,还具有毒性低的特点[6]。 KYBNZ-1I是新研制的一种冬凌草衍生物。该研究显示KYBNZ-1I对Tca8113细胞增殖的抑制作用随药物剂量的增大呈增强的趋势，8.0 mg/L KYBNZ-1I作用72 h后，其增殖抑制率高达93.832%，产生此作用的原因可能是KYBNZ-1I对Tca8113细胞产生了增殖抑制和分化诱导作用。流式细胞术结果显示KYBNZ-1I作用后，G0/G1期细胞比例降低，G2/M 期细胞比例增加，说明KYBNZ-1I可将细胞周期阻滞于G2/M期，可能通过促进Tca8113 细胞DNA合成，阻止其分裂，从而抑制癌细胞的增殖活性；同时，细胞凋亡率也随药物剂量的增大而升高，说明KYBNZ-1I可能通过诱导癌细胞凋亡从而抑制肿瘤的生长。

细胞周期的调控在细胞增殖、分化、凋亡过程中发挥着重要作用。细胞周期调节依赖Cyclin、周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)以及相关调节机制。细胞周期中G1/S期转换受到G1期Cyclin、CDK和CDK抑制剂的调节。细胞周期调控机制异常与细胞异常增殖及恶性肿瘤的发生关系密切。人体细胞周期不同时相都存在关键的调控点，正常情况下CyclinD1结合并激活G1期特有的 CDK4，使Rb蛋白磷酸化，从而释放出转录因子 E2F，E2F 起始转录并激活细胞周期的相关基因，促使细胞由G1期进入S期[7]。国内相关研究[8]证实CyclinD1和CDK4在正常口腔黏膜上皮组织呈低水平表达，在口腔鳞状细胞癌组织中过表达，说明CyclinD1在恶性肿瘤的形成过程中起着十分重要的作用。该研究中以1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用于Tca8113细胞48 h，结果显示细胞CyclinD1蛋白的表达随着药物剂量增加而降低，推测KYBNZ-1I可能阻止Tca8113细胞由DNA合成前期向DNA合成期转化，从而抑制肿瘤细胞增殖。

在细胞有丝分裂前，CyclinB1在细胞内累积， CyclinB1结合Cdc-2形成CyclinB1-Cdc-2复合物，抑制Thr14和Tyr15磷酸化，Thr14和Tyr15磷酸化对有丝分裂起抑制作用[9]。有研究[10]表明CyclinB1一般在有丝分裂前期或中期积累，后期开始减少，在有丝分裂开始时进入细胞核，从而促进整个细胞周期过程。一般而言细胞阻滞于G2期，CyclinB1和Cdc-2活性减弱。该研究中KYBNZ-1I将Tca8113细胞阻滞于G2/M期，而CyclinB1和Cdc-2蛋白的表达水平均随着药物剂量的增加而升高, 机制不详，亦有学者[10]得出与该研究相似的研究结果，具体机制有待进一步研究。

综上所述，KYBNZ-1I对Tca8113细胞增殖有抑制作用,可将细胞阻滞于G2/M期，并可诱导细胞凋亡，其作用机制可能与KYBNZ-1I抑制CyclinD1蛋白的表达、升高CyclinB1和Cdc-2蛋白的表达有关。KYBNZ-1I的发现有望为口腔鳞状细胞癌的治疗提供新的药物。

[1]张超贤,郭李柯,史淑敏.饮酒和细胞外超氧化物岐化酶、乙醛脱氢酶2基因多态性与口腔鳞状细胞癌的相关性研究[J].华西口腔医学杂志,2014,32(2):119

[2]张逸凡,关忠民,陈笑艳,等.抗肿瘤新药埃克替尼在动物体内的药动学和组织分布研究[J].中国新药杂志,2014,23(2):235

[3]Tan F,Shen X,Wang D,et al.Icotinib(BPI-2009H), a novel EGFR tyrosine kinase inhibitor, displays potent efficacy in preclinical studies[J].Lung Cancer,2012,76(2):177

[4]Liu Z,Ouyang L,Peng H,et al.Oridonin:targeting programmed cell death pathways as an anti-tumour agent[J].Cell Prolif,2012,45(6):499

[5]尹波,李志伟,张弩，等.冬凌草甲素对C6大鼠脑胶质瘤裸鼠异种移植模型的抗肿瘤疗效研究[J].肿瘤学杂志,2014,20(1):34

[6]王绍丰,卢啟立.冬凌草的现代研究概况[J].广州医药，2008,39(1):46

[7]黄涛，张令达.口腔鳞状细胞癌组织中p57kip2和Cyclin D1 mRNA的表达及意义[J].安徽医科大学学报,2013,48(4):398

[8]Yunlan L,Juan Z,Qingshan L.Antitumor activity of di-n-butyl-(2,6-difluorobenzohydroxamato)tin(Ⅳ) against human gastric carcinoma SGC-7901 cells via G2/M cell cycle arrest and cell apoptosis[J].PLoS One,2014,9(3):e90793

[9]Hunter T,Pines J.Cyclins and cancer.Ⅱ:Cyclin D and CDK inhibitors come of age[J].Cell,1994,79(4):573

[10]Yuan SY,Lin CC,Hsu SL,et al.Leaf extracts of calocedrus formosana(Florin) induce G2/M cell cycle arrest and apoptosis in human bladder cancer cells[J].Evid Based Complement Alternat Med,2011(2011):380923

(2014-09-30 收稿 责任编辑徐春燕)

Inhibitive effect of KYBNZ-1I on proliferation of Tca8113 cells

CHANGYue1)，WANGWeijia2)，PIAOJunyan3)，YAOKe3)，ZUOFeifei3)，XUShaobo3)，XUXia3)

1)DepartmemtofOrthodontics,CollegeofStomatology,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 3)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

KYBNZ-1I;Tca8113 cell;proliferation;apoptosis;cell cycle

Aim: To investigate the effect of KYBNZ-1I on proliferation of oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113 and the possible mechanism.Methods: The effect of KYBNZ-1I(0.5,1.0,2.0,4.0 and 8.0 mg/L) on proliferation of Tca8113 cells for 24,48 and 72 h was measured by MTT assay. Tca8113 cells were treated by 0.0,1.0,2.0 and 3.0 mg/L KYBNZ-1I for 48 h, then flow cytometry and Western blot were used to detect the cell cycle distribution, apoptosis and the expressions of CyclinD1,CyclinB1 and Cdc-2.Results: KYBNZ-1I inhibited the proliferation of Tca8113 cells in a time and dose dependent manner(Fdose=133.991，Ftime=22.526，P<0.05). Compared with control group, the percentage of G2/M phase Tca8113 cells was significantly higher(F=108.465，P<0.001),and cell apoptosis rate raised(F=212.353，P<0.001) in a dose-dependent manner. With the increase of KYBNZ-1I concentration, the expression of CyclinD1 decreased(F=45.288，P<0.001),and the expressions of CyclinB1 and Cdc-2 increased(F=21.273 and 19.228，P<0.05).Conclusion: KYBNZ-1I could inhibit proliferation, arrest the cells at G2/M phase and induce cell apoptosis, which may be explained by its restraining expression of CyclinD1, and upregulating expressions of CyclinB1 and Cdc-2.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.028

R780.2