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男性原始生殖细胞中LIN28和OCT4的表达*

2015-04-18汪亚芬冯涵琪王兴玲胡旭林纪家葵管一春

郑州大学学报(医学版) 2015年3期
关键词:胞质生殖细胞性腺

汪亚芬,冯涵琪,王兴玲#,胡旭林,纪家葵,管一春,李 丽,刘 芳

1)郑州大学第三附属医院生殖医学科 郑州 450052 2)清华大学医学院干细胞与再生医学中心 北京 100083

男性原始生殖细胞中LIN28和OCT4的表达*

汪亚芬1),冯涵琪1),王兴玲1)#,胡旭林2),纪家葵2),管一春1),李 丽1),刘 芳1)

1)郑州大学第三附属医院生殖医学科 郑州 450052 2)清华大学医学院干细胞与再生医学中心 北京 100083

#通信作者,女,1962年2月生,硕士,教授,研究方向:辅助生殖技术,E-mail:wangxl208@126.com

原始生殖细胞;LIN28;OTC4;男性

目的:分析LIN28在男性原始生殖细胞(PGCs)中的表达变化。方法:收集男性胚胎/胎儿,胎龄为7周、8周、9周、10周、11~12周、13~14周各3例。分离早期胚胎性腺组织,运用免疫荧光技术分析PGCs中LIN28和OCT4的表达。结果:6组睾丸组织中LIN28和OTC4阳性细胞百分数比较,差异均有统计学意义(F=15.651,6.501,P均<0.05)。胎龄第7~14周,OCT4一直定位于PGCs的细胞核中;胎龄第8~9周时,OCT4在PGCs中的表达低于第7周,第10~12周OCT4表达再次升高,而在第13周后,OCT4表达逐渐降低。从胎龄第7周开始直至第14周, PGCs中LIN28蛋白的表达逐渐增强,在胎龄第13~14周达到最高峰。在定位上,在胎龄第7周时LIN28表达于PGCs胞核内;在胎龄第8~9周时,PGCs胞核和胞质中均可观察到LIN28的表达;而在胎龄第10周以后,部分PGCs仅胞质中表达LIN28;在胎龄第11~14周时LIN28均定位于PGCs的胞质中。结论:LIN28可能是一个可行的、比较稳定的雄性生殖细胞标记因子。

人类原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是各型生殖细胞的起源细胞(祖细胞),在人类的生存和发展进程中发挥重要作用[1-2]。PGCs的成熟过程呈阶段性发展并被精密地调控着[3]。胎龄2~3周时,人类早期胚胎开始出现PGCs。胎龄5~6周时,PGCs迁徙到原始生殖嵴。迁移后的PGCs经过一系列的扩增与初始分化,形成(5~7)百万个卵原或精原细胞,这些原始细胞被支持细胞和体细胞围绕,共同组成早期性腺。迁移后的PGCs时期是细胞增殖和性别分化的决定时期,内源性调控机制主要包括4个方面:RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)调控、转录因子调控、全能性基因调控和表观遗传调控[4-5]。LIN28是一种高度保守的RBP,是生殖细胞增殖和分化过程中必不可少的因子,与人类睾丸生殖细胞肿瘤的发生密切相关[6-7]。体外诱导实验[8]发现,LIN28在人胚胎干细胞中高度表达,并且可以提高多能干细胞向生殖干细胞的转化效率。八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)是一个著名的早期生殖细胞标记物,目前常用于生殖领域的研究标记[9-10]。作者对LIN28 和OCT4在男胎早期性腺组织中的表达情况进行了检测,分析其在PGCs中表达的变化趋势,以期找到适用于生殖细胞发育不同阶段的标记物,为进一步揭示人类生殖细胞的发生、发育、成熟的调节机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源 研究经郑州大学第三附属医院生殖伦理委员会批准,在患者签署相应的知情同意书后,收集标本,其中多胎妊娠减胎术后废弃胚胎4例,人工流产、药物流产后废弃胚胎/胎儿20例,引产清宫后废弃胎儿3例。胚胎/胎儿均为男性,胎龄6~14周。未发现两种因子的6周减胎标本不纳入研究。最终纳入18例,将标本按胎龄(7周、8周、9周、10周、11~12周、13~14周)分为6组,每组3例。性腺的收集在术后24 h内完成。在体式显微镜下进行早期胚胎性腺组织的分离。胎龄6~20周,性腺高度平膀胱,位于其两侧,镜下大小如黄豆状,10周前可以看到未分化的条状的中肾组织,可帮助辨别性腺组织。性腺组织取出后立即投入装满Bouins液的EP管中,-80 ℃保存。

1.2 主要试剂 羊抗人LIN28多克隆抗体(R&D公司),兔抗人OCT4多克隆抗体(Abcam公司),Alexa Fluor 555荧光二抗、Alexa Fluor 633荧光二抗(Invitrogen公司),驴血清blocking液和SRY-box PCR试剂盒(Life Technologies公司)。

1.3 性别鉴定 利用PCR技术对新鲜收集的标本进行Y染色体性别决定区(sex determining region,SRY)基因检测。使用已知老鼠雄性肾脏组织作阳性对照(人鼠SRY基因同源),用成年女子心脏组织(Biochain公司)作阴性对照。鉴定方法参考文献[11]。

1.4 睾丸组织中LIN28 和OCT4蛋白的检测 采用免疫荧光技术。将所取睾丸组织用Bouins液固定,蔗糖脱水后制成冰冻切片并-80 ℃保存。切片取出后首先在柠檬酸中加热修复(96 ℃10 min),然后驴血清封闭(室温1 h),加入稀释100倍的LIN28及OCT4一抗4 ℃孵育过夜,PBST洗涤3次,在暗室中加入稀释100倍的荧光二抗室温孵育50 min,再次PBST洗涤3次,加入细胞核着色剂DAPI(500倍稀释,室温,15 min),洗涤同上,在盖玻片上加入抗淬灭剂并在激光共聚焦显微镜下拍照。选取3张片子进行观察,计数细胞[12]。阳性细胞百分数=阳性细胞数/PGCs数×100%。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计学处理,组间LIN28和OCT4阳性细胞百分数的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 性别鉴定结果 以10周、11周两组标本为例,电泳图见图1。可以看到,两组标本的电泳图与阳性对照一致,在250 bp处有单一明亮条带,可以认为样本均为男性胚胎/胎儿,所取性腺组织为睾丸组织。

图1 SRY-PCR结果

2.2 LIN28和OCT4在PGCs中的亚细胞定位 标记蛋白OCT4在胚胎和早期胎儿发育过程中一直定位于PGCs胞核中。但LIN28的定位存在变化。在胎龄第7周(图2A)时,LIN28表达于PGCs胞核内;在第8~9周(图2B)时,PGCs胞核和胞质中均表达LIN28;而第10周以后,出现LIN28只在胞质中的PGCs(图2C);第11~14周时,LIN28均定位于PGCs胞质中(图2D)。

2.3 PGCs中LIN28和OCT4蛋白表达水平的变化 见表1。胎龄第7~13周的胎儿睾丸组织中OCT4和LIN28蛋白表达结果显示,随着胎龄的增加,LIN28的表达逐渐增高,第13~14周时PGCs中LIN28阳性细胞百分数达到可见的最高峰32.580%;OCT4表达在胎龄第7周和11~12周出现两个峰值,而在胎龄第13周后,OCT4阳性细胞就很少被观测到。

图2 LIN28在PGCs中亚细胞定位的变化

A:胎龄第7周;B:胎龄第8~9周;C:胎龄第10周;D:胎龄第11~14周。

表1 不同胎龄胚胎/胎儿睾丸组织中LIN28和OCT4蛋白表达的比较

组间两两比较,P均<0.05。

3 讨论

3.1 PGCs早期发育过程中OCT4表达的变化 OCT4在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新方面起关键作用[13],其在孕早期性腺中特异性高表达。当早期PGCs到达生殖脊后,性索开始出现,这个时期相当于胎龄第7~9周,然后生殖细胞通过有丝分裂进行增殖。雌性生殖细胞在胎龄第10周时开始进行减数分裂, 而雄性生殖细胞直到青春期才开始这一过程。在雄性胎儿生殖细胞早期发育时期,细胞分裂为3个亚种群:生殖母细胞群、中间细胞群和前精原细胞群[14]。OCT4阳性细胞在形态学上为生殖母细胞群,这些细胞拥有圆的、规则的细胞核,核质比高。该研究结果显示,在早期(胎龄第7~14周)胚胎发育过程中,标记蛋白OCT4一直定位于PGCs胞核中;OCT4表达在胎龄第8~9周时低于第7周,第10~12周时OCT4表达再次升高,而在第13周以后,OCT4表达就逐渐降低。提示OCT4是一个稳定的早期PGCs标记蛋白,这与其他学者[15]认为的OCT4作为一种早期PGCs标记并高度特异表达相一致。

3.2 PGCs早期发育过程中LIN28表达的变化 LIN28是一种在人胎儿睾丸发育过程中和成年人睾丸中表达的限定基因,是推测的生殖细胞标记因子[16]。该研究结果表明,从胎龄第7周开始直至第14周, PGCs中LIN28蛋白的表达逐渐增强,在胎龄第13~14周时达到最高峰。在定位上,在胎龄第7周时LIN28表达于PGCs胞核内;在胎龄第8~9周时,PGCs胞核和胞质中均可观察到LIN28的表达;而胎龄第10周以后,出现部分LIN28仅表达于胞质中的PGCs;胎龄第11~14周时LIN28均定位于PGCs胞质中。据此推测,与早期因子OCT4比较,LIN28是一个表达时限稍长的PGCs发育早中期标记因子。LIN28蛋白含有保守的核定位序列PRKRK,推测LIN28先在细胞核中合成,发挥相关作用后,在生殖细胞发育过程的某个阶段,其与出核载体蛋白结合,被转运入细胞质。既往研究[17-18]发现LIN28可通过负向调控let-7 miRNA而促进PRDM1的表达,导致胚胎干细胞的分化和PGCs的形成及扩增。PGCs早期发育过程中LIN28表达模式的变化很可能跟相关信号传导有关。

3.3 PGCs早期发育过程中LIN28与OCT4的相互作用 当细胞在一个时段同时表达两个蛋白,可以认为这两个蛋白在特定时期的特定细胞中共表达。在亚细胞水平,如果共表达的两个对象在胞内分布有重叠称为共定位,共定位至少为两者可能存在的相互作用提供了一个必要条件。该研究结果显示,在胚胎早期发育阶段(胎龄第7周),只有一小部分PGCs共表达LIN28和OCT4,随着睾丸组织的发育,LIN28和OCT4共表达的PGCs比例逐渐增高,在胎龄第11~12周时共表达的PGCs比例达到100%。这提示LIN28和OCT4可能具有某些更深刻的相互关系来共同调控PGCs形成和发育。

综上所述,作者认为,RNA结合蛋白LIN28是一个可行的、稳定的雄性PGCs标记因子,这为原始生殖细胞发育机制的研究提供了参考。

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(2014-10-18 收稿 责任编辑王 曼)

Expressions of LIN28 and OTC4 in male primordial germ cells

WANGYafen1),FENGHanqi1),WANGXingling1),HUXulin2),JIJiakui2),GUANYichun1),LILi1),LIUFang1)

1)DepartmentofReproductiveMedicine,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)CenterforStemCellandRegenerativeMedicine,CollegeofMedicalSciences,TsinghuaUniversity,Beijing100083

primordial germ cell; LIN28; OCT4; male

Aim: To explore the expression of LIN28 in the male primordial germ cells(PGCs). Methods: The male embryo/fetus were collected(gestational age of 7 weeks, 8 weeks, 9 weeks, 10 weeks, 11-12 weeks, 13-14 weeks was 3 cases,respectively) to obtain human fetal testicular tissue. Immunofluorescence technique was used to detect the expressions of LIN28 and OCT4 in PGCs. Results: There were significant differences in the expressions of LIN28 and OCT4 among the 6 groups(F=15.651,6.501,P<0.05).At the gestational age of 7-14 weeks,OCT4 was located in the nucleus of PGCs. The expression of OCT4 in PGCs at the gestational age of 8-9 weeks was lower than that at the gestational age of 7 weeks, and it increased at the gestational age of 10-12 weeks, decreased after the gestational age of 13 weeks. From the gestational age of 7 to 14 weeks, the expression of LIN28 in PGCs increased gradually, and reached to the peak at the gestational age of 13-14 weeks. At the gestational age of 7 weeks,LIN28 expressed within the nuclei of PGCs. At the gestational age of 8-9 weeks, LIN28 expressed within the nucleus and cytoplasm of PGCs, LIN28 only expressed in the cytoplasm in partial PGCs at gestational age of 10 weeks. At the gestational age of 11-14 weeks,LIN28 was positioned in the cytoplasm of PGCs. Conclusion: LIN28 may be a feasible and relatively stable male primordial germ cell marker.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.021

*河南省科技厅国际合作项目 124300510011

R714.1

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