男性原始生殖细胞中LIN28和OCT4的表达*

汪亚芬，冯涵琪，王兴玲#，胡旭林，纪家葵，管一春，李 丽，刘 芳

1)郑州大学第三附属医院生殖医学科 郑州 450052 2)清华大学医学院干细胞与再生医学中心 北京 100083

男性原始生殖细胞中LIN28和OCT4的表达*

汪亚芬1)，冯涵琪1)，王兴玲1)#，胡旭林2)，纪家葵2)，管一春1)，李 丽1)，刘 芳1)

1)郑州大学第三附属医院生殖医学科 郑州 450052 2)清华大学医学院干细胞与再生医学中心 北京 100083

#通信作者，女，1962年2月生，硕士，教授，研究方向：辅助生殖技术，E-mail：wangxl208@126.com

原始生殖细胞；LIN28；OTC4；男性

目的：分析LIN28在男性原始生殖细胞(PGCs)中的表达变化。方法：收集男性胚胎/胎儿，胎龄为7周、8周、9周、10周、11～12周、13～14周各3例。分离早期胚胎性腺组织，运用免疫荧光技术分析PGCs中LIN28和OCT4的表达。结果：6组睾丸组织中LIN28和OTC4阳性细胞百分数比较，差异均有统计学意义(F=15.651,6.501，P均<0.05)。胎龄第7～14周，OCT4一直定位于PGCs的细胞核中；胎龄第8～9周时，OCT4在PGCs中的表达低于第7周，第10～12周OCT4表达再次升高，而在第13周后，OCT4表达逐渐降低。从胎龄第7周开始直至第14周， PGCs中LIN28蛋白的表达逐渐增强，在胎龄第13～14周达到最高峰。在定位上，在胎龄第7周时LIN28表达于PGCs胞核内；在胎龄第8～9周时，PGCs胞核和胞质中均可观察到LIN28的表达；而在胎龄第10周以后，部分PGCs仅胞质中表达LIN28；在胎龄第11～14周时LIN28均定位于PGCs的胞质中。结论：LIN28可能是一个可行的、比较稳定的雄性生殖细胞标记因子。

人类原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是各型生殖细胞的起源细胞(祖细胞)，在人类的生存和发展进程中发挥重要作用[1-2]。PGCs的成熟过程呈阶段性发展并被精密地调控着[3]。胎龄2～3周时，人类早期胚胎开始出现PGCs。胎龄5～6周时，PGCs迁徙到原始生殖嵴。迁移后的PGCs经过一系列的扩增与初始分化，形成(5～7)百万个卵原或精原细胞，这些原始细胞被支持细胞和体细胞围绕，共同组成早期性腺。迁移后的PGCs时期是细胞增殖和性别分化的决定时期，内源性调控机制主要包括4个方面：RNA结合蛋白(RNA-binding protein，RBP)调控、转录因子调控、全能性基因调控和表观遗传调控[4-5]。LIN28是一种高度保守的RBP，是生殖细胞增殖和分化过程中必不可少的因子，与人类睾丸生殖细胞肿瘤的发生密切相关[6-7]。体外诱导实验[8]发现，LIN28在人胚胎干细胞中高度表达，并且可以提高多能干细胞向生殖干细胞的转化效率。八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)是一个著名的早期生殖细胞标记物，目前常用于生殖领域的研究标记[9-10]。作者对LIN28 和OCT4在男胎早期性腺组织中的表达情况进行了检测，分析其在PGCs中表达的变化趋势，以期找到适用于生殖细胞发育不同阶段的标记物，为进一步揭示人类生殖细胞的发生、发育、成熟的调节机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源 研究经郑州大学第三附属医院生殖伦理委员会批准，在患者签署相应的知情同意书后，收集标本，其中多胎妊娠减胎术后废弃胚胎4例，人工流产、药物流产后废弃胚胎/胎儿20例，引产清宫后废弃胎儿3例。胚胎/胎儿均为男性，胎龄6～14周。未发现两种因子的6周减胎标本不纳入研究。最终纳入18例，将标本按胎龄(7周、8周、9周、10周、11～12周、13～14周)分为6组，每组3例。性腺的收集在术后24 h内完成。在体式显微镜下进行早期胚胎性腺组织的分离。胎龄6～20周，性腺高度平膀胱，位于其两侧，镜下大小如黄豆状，10周前可以看到未分化的条状的中肾组织，可帮助辨别性腺组织。性腺组织取出后立即投入装满Bouins液的EP管中，-80 ℃保存。

1.2 主要试剂 羊抗人LIN28多克隆抗体(R&D公司)，兔抗人OCT4多克隆抗体(Abcam公司)，Alexa Fluor 555荧光二抗、Alexa Fluor 633荧光二抗(Invitrogen公司)，驴血清blocking液和SRY-box PCR试剂盒(Life Technologies公司)。

1.3 性别鉴定 利用PCR技术对新鲜收集的标本进行Y染色体性别决定区(sex determining region，SRY)基因检测。使用已知老鼠雄性肾脏组织作阳性对照(人鼠SRY基因同源)，用成年女子心脏组织(Biochain公司)作阴性对照。鉴定方法参考文献[11]。

1.4 睾丸组织中LIN28 和OCT4蛋白的检测 采用免疫荧光技术。将所取睾丸组织用Bouins液固定，蔗糖脱水后制成冰冻切片并-80 ℃保存。切片取出后首先在柠檬酸中加热修复(96 ℃10 min)，然后驴血清封闭(室温1 h)，加入稀释100倍的LIN28及OCT4一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗涤3次，在暗室中加入稀释100倍的荧光二抗室温孵育50 min，再次PBST洗涤3次，加入细胞核着色剂DAPI(500倍稀释，室温，15 min)，洗涤同上，在盖玻片上加入抗淬灭剂并在激光共聚焦显微镜下拍照。选取3张片子进行观察，计数细胞[12]。阳性细胞百分数=阳性细胞数/PGCs数×100%。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计学处理，组间LIN28和OCT4阳性细胞百分数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 性别鉴定结果 以10周、11周两组标本为例，电泳图见图1。可以看到，两组标本的电泳图与阳性对照一致，在250 bp处有单一明亮条带，可以认为样本均为男性胚胎/胎儿，所取性腺组织为睾丸组织。

图1 SRY-PCR结果

2.2 LIN28和OCT4在PGCs中的亚细胞定位 标记蛋白OCT4在胚胎和早期胎儿发育过程中一直定位于PGCs胞核中。但LIN28的定位存在变化。在胎龄第7周(图2A)时，LIN28表达于PGCs胞核内；在第8～9周(图2B)时，PGCs胞核和胞质中均表达LIN28；而第10周以后，出现LIN28只在胞质中的PGCs(图2C)；第11～14周时，LIN28均定位于PGCs胞质中(图2D)。

2.3 PGCs中LIN28和OCT4蛋白表达水平的变化 见表1。胎龄第7～13周的胎儿睾丸组织中OCT4和LIN28蛋白表达结果显示，随着胎龄的增加，LIN28的表达逐渐增高，第13～14周时PGCs中LIN28阳性细胞百分数达到可见的最高峰32.580%；OCT4表达在胎龄第7周和11～12周出现两个峰值，而在胎龄第13周后，OCT4阳性细胞就很少被观测到。

图2 LIN28在PGCs中亚细胞定位的变化

A：胎龄第7周；B：胎龄第8～9周；C：胎龄第10周；D：胎龄第11～14周。

表1 不同胎龄胚胎/胎儿睾丸组织中LIN28和OCT4蛋白表达的比较

组间两两比较，P均<0.05。

3 讨论

3.1 PGCs早期发育过程中OCT4表达的变化 OCT4在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新方面起关键作用[13]，其在孕早期性腺中特异性高表达。当早期PGCs到达生殖脊后，性索开始出现，这个时期相当于胎龄第7～9周，然后生殖细胞通过有丝分裂进行增殖。雌性生殖细胞在胎龄第10周时开始进行减数分裂， 而雄性生殖细胞直到青春期才开始这一过程。在雄性胎儿生殖细胞早期发育时期，细胞分裂为3个亚种群：生殖母细胞群、中间细胞群和前精原细胞群[14]。OCT4阳性细胞在形态学上为生殖母细胞群，这些细胞拥有圆的、规则的细胞核，核质比高。该研究结果显示，在早期(胎龄第7～14周)胚胎发育过程中，标记蛋白OCT4一直定位于PGCs胞核中；OCT4表达在胎龄第8～9周时低于第7周，第10～12周时OCT4表达再次升高，而在第13周以后，OCT4表达就逐渐降低。提示OCT4是一个稳定的早期PGCs标记蛋白，这与其他学者[15]认为的OCT4作为一种早期PGCs标记并高度特异表达相一致。

3.2 PGCs早期发育过程中LIN28表达的变化 LIN28是一种在人胎儿睾丸发育过程中和成年人睾丸中表达的限定基因，是推测的生殖细胞标记因子[16]。该研究结果表明，从胎龄第7周开始直至第14周， PGCs中LIN28蛋白的表达逐渐增强，在胎龄第13～14周时达到最高峰。在定位上，在胎龄第7周时LIN28表达于PGCs胞核内；在胎龄第8～9周时，PGCs胞核和胞质中均可观察到LIN28的表达；而胎龄第10周以后，出现部分LIN28仅表达于胞质中的PGCs；胎龄第11～14周时LIN28均定位于PGCs胞质中。据此推测，与早期因子OCT4比较，LIN28是一个表达时限稍长的PGCs发育早中期标记因子。LIN28蛋白含有保守的核定位序列PRKRK，推测LIN28先在细胞核中合成，发挥相关作用后，在生殖细胞发育过程的某个阶段，其与出核载体蛋白结合，被转运入细胞质。既往研究[17-18]发现LIN28可通过负向调控let-7 miRNA而促进PRDM1的表达，导致胚胎干细胞的分化和PGCs的形成及扩增。PGCs早期发育过程中LIN28表达模式的变化很可能跟相关信号传导有关。

3.3 PGCs早期发育过程中LIN28与OCT4的相互作用 当细胞在一个时段同时表达两个蛋白，可以认为这两个蛋白在特定时期的特定细胞中共表达。在亚细胞水平，如果共表达的两个对象在胞内分布有重叠称为共定位，共定位至少为两者可能存在的相互作用提供了一个必要条件。该研究结果显示，在胚胎早期发育阶段(胎龄第7周)，只有一小部分PGCs共表达LIN28和OCT4，随着睾丸组织的发育，LIN28和OCT4共表达的PGCs比例逐渐增高，在胎龄第11～12周时共表达的PGCs比例达到100%。这提示LIN28和OCT4可能具有某些更深刻的相互关系来共同调控PGCs形成和发育。

综上所述，作者认为，RNA结合蛋白LIN28是一个可行的、稳定的雄性PGCs标记因子，这为原始生殖细胞发育机制的研究提供了参考。

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(2014-10-18 收稿 责任编辑王 曼)

Expressions of LIN28 and OTC4 in male primordial germ cells

WANGYafen1)，FENGHanqi1)，WANGXingling1)，HUXulin2)，JIJiakui2)，GUANYichun1)，LILi1)，LIUFang1)

1)DepartmentofReproductiveMedicine,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)CenterforStemCellandRegenerativeMedicine,CollegeofMedicalSciences，TsinghuaUniversity,Beijing100083

primordial germ cell; LIN28; OCT4; male

Aim: To explore the expression of LIN28 in the male primordial germ cells(PGCs). Methods: The male embryo/fetus were collected(gestational age of 7 weeks, 8 weeks, 9 weeks, 10 weeks, 11-12 weeks, 13-14 weeks was 3 cases,respectively) to obtain human fetal testicular tissue. Immunofluorescence technique was used to detect the expressions of LIN28 and OCT4 in PGCs. Results: There were significant differences in the expressions of LIN28 and OCT4 among the 6 groups(F=15.651,6.501，P<0.05).At the gestational age of 7-14 weeks,OCT4 was located in the nucleus of PGCs. The expression of OCT4 in PGCs at the gestational age of 8-9 weeks was lower than that at the gestational age of 7 weeks, and it increased at the gestational age of 10-12 weeks, decreased after the gestational age of 13 weeks. From the gestational age of 7 to 14 weeks, the expression of LIN28 in PGCs increased gradually, and reached to the peak at the gestational age of 13-14 weeks. At the gestational age of 7 weeks,LIN28 expressed within the nuclei of PGCs. At the gestational age of 8-9 weeks, LIN28 expressed within the nucleus and cytoplasm of PGCs, LIN28 only expressed in the cytoplasm in partial PGCs at gestational age of 10 weeks. At the gestational age of 11-14 weeks,LIN28 was positioned in the cytoplasm of PGCs. Conclusion: LIN28 may be a feasible and relatively stable male primordial germ cell marker.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.021

*河南省科技厅国际合作项目 124300510011

R714.1