CUEDC2在肝细胞癌组织中的表达及其临床预后的意义*

王伯庆， 薛 峰， 丁 伟△， 唐建军， 康铁邦， 毛拉艾沙·买买提， 李海军， 唐津天， 董晓刚， 尹继炜， 依马木买买提江·阿布拉， 易 超， 徐 林， 佟 庆， 张国庆△

(1新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科，新疆 乌鲁木齐 830011； 2华南肿瘤学国家重点实验室，中山大学肿瘤防治中心，广东 广州 510060)



CUEDC2在肝细胞癌组织中的表达及其临床预后的意义*

王伯庆1， 薛 峰1， 丁 伟1△， 唐建军2， 康铁邦2， 毛拉艾沙·买买提1， 李海军1， 唐津天1， 董晓刚1， 尹继炜1， 依马木买买提江·阿布拉1， 易 超1， 徐 林1， 佟 庆1， 张国庆1△

(1新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科，新疆 乌鲁木齐 830011；2华南肿瘤学国家重点实验室，中山大学肿瘤防治中心，广东 广州 510060)

目的： 检测含CUE结构域蛋白2(CUEDC2)在肝细胞癌组织中的表达，探讨其与临床预后的关系。方法： 选取具有完整临床及预后资料的186例手术切除肝细胞癌组织的石蜡组织标本，采用免疫组化技术检测CUEDC2的表达，并结合肝癌临床病理因素及预后进行分析。结果： CUEDC2在85.5% (159/186)的肝癌组织中有表达, 其中低表达为52.2%(97/186)，高表达为47.8% (89/186)；CUEDC2的表达状态与血清甲胎蛋白(AFP)水平、肿瘤大小、肿瘤数目、肝癌分化程度和TNM分期有关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示CUEDC2高表达的患者术后总生存及无复发生存期较低表达者显著缩短;多因素Cox回归分析显示CUEDC2的表达状态、血清AFP和肿瘤数目是影响肝癌患者术后无复发生存(RFS)及总生存期(OS)的独立危险因素。结论： CUEDC2在多数肝癌组织中有表达，与肿瘤的生长、分化及预后有关；CUEDC2可以作为一个有价值的肝癌预后预测的新指标。

肝肿瘤； 肝切除术； CUEDC2蛋白； 预后

原发性肝癌是最常见的消化系统肿瘤之一，发病率在全球恶性肿瘤中位居第五，死因位居第三，全球每年新发病例中约50%来自中国[1]。肝细胞癌(以下简称肝癌)占原发性肝癌的91.5%，由于其恶性程度高，对放化疗不敏感，肝癌术后的总体5年生存率仅30%～50%。影响肝癌发生发展及预后的因素是多方面的，其中细胞周期异常被认为在肝癌的发生发展中起着重要的作用[2]。因此，检测肝癌组织中调节细胞周期的关键蛋白，可能对肝癌预后判断提供有意义的信息。

含CUE结构域蛋白2(CUE domain-containing 2,CUEDC2)是一个重要的细胞周期调节分子，同时还具有调控炎症、免疫、肿瘤耐药等重要功能[3]。CUEDC2广泛表达于许多真核细胞，并且在乳腺癌、卵巢癌、肾癌等多种肿瘤组织中呈异常高表达，促使细胞有丝分裂异常和基因组不稳定，是肿瘤发生、发展密切相关因素[4]。然而，在结肠癌组织中的巨噬细胞，却几乎检测不到CUEDC2表达，这种表达缺失导致结肠黏膜遭受过度炎症刺激而最终发生肿瘤[5]。因此，以上提示CUEDC2在不同肿瘤中表达定位及发挥的作用可能不同。目前，CUEDC2与肝癌的研究尚未见报道，我们感兴趣的是CUEDC2在肝癌组织中的表达，并初步探讨其与临床病理因素间的关系及预后预测价值。

材 料 和 方 法

1 临床资料

收集新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科2002年1月至2004年3月行手术切除的肝细胞癌患者的石蜡标本186例，所有蜡块组织均取材于肝癌与癌旁组织交界区。所有患者具有完整存档病历和随访资料。186例肝癌患者中，男性165例，女性21例，年龄28～76岁，中位年龄52岁，所有患者术前均未接受放、化疗等抗肿瘤治疗，治疗方式均为根治性手术切除。按照入选标准，连续性选择本组肝癌患者。另外，收集手术切除的新鲜组织样本，分别取材于肝癌及距肿瘤2 cm的非肿瘤肝组织，立即冻存于-80 ℃冰箱备用。

2 主要实验方法

2.1 免疫组化染色 所有经手术切除组织标本，用10%甲醛固定，常规脱水并石蜡包埋，制成4 μm组织切片，经HE染色病理证实的肝癌，进一步做免疫组化染色。组织玻片于温热的二甲苯溶液充分脱蜡后，分别于梯度乙醇中浸泡水化；3%H2O2孵育，以阻断内源性过氧化物酶；切片放入柠檬酸盐缓冲液中，微波加热修复抗原；滴加非免疫性山羊血清(Beyotime)，室温封闭30 min；滴加兔抗人CUEDC2特异性抗体(Abcam, 1∶400)，4 ℃过夜；PBS冲洗，滴加HRP II抗(Genetech, 500710)，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗，DAB显色；苏木精复染细胞核，二甲苯透明，中性树脂封片。用已知染色强阳性的组织切片作为阳性对照，用山羊血清代替Ⅰ抗作为阴性对照，PBS代替Ⅰ抗作为空白对照。血管侵犯的判断标准：肝癌的HE染色组织切片，在光学显微镜下观察，在肝脏静脉或肿瘤包膜的静脉内出现癌栓。多发肿瘤是指肿瘤数目在2个或2个以上，但仍局限于肝脏的一半、一叶或一段内，可以是多原发，也可以是卫星结节。

2.2 免疫组化染色结果评分标准 根据阳性细胞所占比例和染色深度进行综合评分。CUEDC2蛋白主要定位于细胞质，在组织切片中胞质染为高于背景的淡黄、棕黄、黄褐色者为阳性反应细胞。细胞无显色为0分;淡黄色为1分；棕黄色为 2分；黄褐色为3分。每张切片随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞，得出阳性细胞百分比并赋分：无阳性细胞为0分， 10%～30%为 1分，31%～50%为 2分，>50%为3分。每例的最终染色评分值为上述2个评分的乘积。按评分高低分级，≤6分为低表达，>6分为高表达。以上结果均由2位病理专科医师独立阅片并评分。

2.3 Western blotting检测 分别收取手术切除的肝癌与癌旁非肿瘤肝组织样本，提取总蛋白后，取等量样品加入考马斯亮蓝的Bradford工作液充分反应后，用多功能酶标仪检测计算蛋白浓度，取等量蛋白20 μg，用10% SDS-PAGE分离，将蛋白转至PVDF膜，用β-tubulin抗体(Cell signal technology, 1∶10 000)作为内参照，将膜放入5%的脱脂奶粉中室温摇床封闭2 h，目的条带加CUEDC2Ⅰ抗(Abcam，1∶600)放入冰箱4 ℃孵育过夜。用TBST洗膜后，用HRP偶联的Ⅱ抗(Promega，1∶10 000)，室温孵育1 h。TBST洗膜后，在暗房显影，X光片压片后，冲洗胶片。

2.4 无复发生存期及总体生存期评定与随访 生存时间按月计算，自手术切除肿瘤日至诊断肿瘤复发或患者死亡为无复发生存期(recurrence-free survival, RFS)，总生存期(overall survival, OS)为手术当日至死亡日或最近一次随访。本研究中共入组186例接受肝癌根治性切除患者，术后定期随访，采用病历跟踪、电话随访及信件随访的方式，综合临床体征、影像学检查(B超、CT或MRI等)以及 甲胎蛋白(alpha-fetal protein, AFP)结果，提示肝脏或远处器官出现新病灶，即诊断为肿瘤复发。随访截止日期为2011年 9月30日，中位随访时间45个月(3～105 个月)，无失访。死因均由肝肿瘤本身所致。

3 统计学处理

运用SPSS 16.0软件进行统计分析。CUEDC2蛋白表达与临床病理因素的关系采用2检验或Fish确切概率法检验，采用Kaplan-Meier法的log-rank检验计算比较累积生存率，Cox回归模型进行单因素及多因素生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CUEDC2蛋白在肝癌及癌旁肝组织中的表达

Western blotting实验显示CUEDC2蛋白在肝癌组织的表达较癌旁肝组织的表达呈现增高趋势，见图1。免疫组化检测的结果显示，CUEDC2在85.5%(159/186)的肝癌组织中有表达, 其中低表达为52.2% (97/186)，高表达为47.8% (89/186)。肝癌组织中CUEDC2蛋白表达主要定位于细胞浆，细胞浆中表现为存在不同染色深度的黄色颗粒，随着肝癌细胞分化级别的降低，CUEDC2蛋白表达呈现上调趋势，见图2。癌旁肝组织中CUEDC2亦有表达，且主要位于肝细胞浆中，多呈淡黄色弱阳性表达。仅在少数病例的肝癌及癌旁肝组织中可见CUEDC2阳性信号入核。

Figure 1.CUEDC2 expression was detected in clinical tissue specimens. Western blotting indicated that CUEDC2 protein level was higher in tumor tissues (T) than that in non-tumor counterparts (N). β-tubulin was used as the loading control.

2 CUEDC2蛋白表达与肝癌患者各临床病理因素间的关系

由表1可见，CUEDC2蛋白表达状态与术前血清AFP 水平、肿瘤直径、肿瘤数目、肿瘤分化程度和TNM分期有关(P<0.05)，但与肝癌患者的性别、年龄、乙肝的感染状态、有无肝硬化和有无血管侵犯等临床病理因素无明显关系(P>0.05)。

Figure 2.HE (×200) and corresponding IHC (×200) staining images of CUEDC2 protein from 4 patients (A, B, C and D). Grades of HCC differentiation (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ) was identified according to Edmonson Steiner method. A: negative staining was well differentiated; B: weak staining was moderately differentiated; C: moderately staining was poorly differentiated; D: strong staining was undifferentiated. CUEDC2 was detectable in cytoplasm of HCC,and the intensities of cytoplasmic CUEDC2 signal of HCC specimens were scored as 4 grades (3, 2, 1, 0) as indicated. The positive cells were stained brown.

3 肝癌预后影响因素的单因素和多因素分析

本研究共引入11项可能影响肝癌患者术后生存的临床病理因素，包括患者性别、年龄、乙肝病毒感染状态、术前血清AFP 水平、有无肝硬化、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤分化程度、血管侵犯和TNM分期。Cox单因素分析结果显示，术前血清AFP水平、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤分化级别、TNM分期和CUEDC2表达水平均显著影响患者术后总体生存期与无复发生存期(P<0.05)，见表2。将上述单因素分析得出的对肝癌患者预后有意义的因素引入Cox回归模型，进行多因素分析，结果提示，术前血清AFP、肿瘤数目和CUEDC2蛋白表达状态均是影响患者术后总体生存期及无复发生存期的独立预后因素(P<0.05)，见表3。

4 生存分析(Kaplan-Meier法)

根据CUEDC2蛋白表达水平绘制总生存及无复发生存曲线。 CUEDC2蛋白高表达者术后5年的累积总生存及无复发生存率均显著低于低表达者(P<0.05)。见图3。

表1 CUEDC2在186例手术切除的肝癌中的表达与临床病理参数的关系

HCC: hepatocellular carcinoma; HBsAg: hepatitis B surface antigen; AFP: α-fetal protein; TNM: tumor-node-metastasis;aAccording to 6th edition AJCC/ UICC TNM stage system, no patients in stage Ⅳ.

讨 论

目前，AFP仍是肝癌重要的诊断及预后预测标记物，但临床上有40%的小肝癌患者AFP呈现假阴性[6]，因此，寻找更多有价值的肝癌诊断、预后标志物具有重要的临床意义[7-8]。

CUEDC2是一个与多种肿瘤有关的新蛋白，在肿瘤中的功能研究包括肿瘤形成和对肿瘤的治疗反应等方面，具体包括细胞周期、炎症和类固醇受体等。它的CUE功能结构域是一个中度保守的泛素结合结构，参与泛素蛋白酶体途径，促进蛋白质分子的泛素化与降解。基因敲低实验发现，敲低CUEDC2可导致细胞有丝分裂后期发生的延迟[9]。Zhang等[10]发现，CUEDC2可通过控制炎症因素激活的NF-κB信号强度，完成机体对炎症反应的精确调控，避免炎症过度反应并损伤自身组织。原发性肝癌多数是在病毒性肝炎长期感染炎症刺激下发生，CUEDC2在其中的作用还有待研究。Gao等[4]发现：CUEDC2 除了在细胞周期、NF-κB信号通路调节发挥重要作用，而且在多种肿瘤组织中表达上调，参与了肿瘤的发生、发展。

本研究免疫组化染色发现，CUEDC2在多数肝癌组织中均有表达，高表达占47.8% (89/186)。重要的是随着肝癌细胞分化程度的降低CUEDC2表达呈现升高趋势，提示CUEDC2参与了肝癌的恶性生物学行为。CUEDC2与肝癌临床病理因素间的关系发现：CUEDC2表达水平与术前血清AFP水平、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤分化程度、TNM分期相关，而与其它因素无显著相关，提示CUEDC2可作为血清AFP的协同预测指标。本组病例中的大肿瘤，多发肿瘤，组织细胞分化差及分期较晚的肝癌CUEDC2呈相对高表达，推测CUEDC2可能参与了肝癌细胞的恶性增殖过程，具有潜在的促癌功能，与以往的研究结果一致[4, 11]。

CUEDC2与多种肿瘤组织耐药有关。Pan等[12]在449例乳腺癌样本中CUEDC2的表达显著增高，而且与 ER水平呈现负相关。机制上证明CUEDC2可使ER泛素化降解，并促进肿瘤细胞增殖，导致内分泌治疗耐药[13]。然而，CUEDC2却可以使慢性粒细胞白血病细胞对依马替尼的耐药性逆转[14]。说明CUEDC2在不同肿瘤的耐药中具有不同的作用机制。一直以来，索拉非尼耐药是制约肝癌分子靶向治疗的瓶颈，CUEDC2在索拉非尼耐药中是否有作用及其作用机制，是我们今后值得探索的问题。

Cox单因素分析发现影响肝癌预后(OS和RFS)的因素包括CUEDC2表达、术前血清AFP水平、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤分化程度和TNM分期。肝癌血管侵犯是预后不良的标志，本组未得出显著意义，考虑与本组中血管侵犯病例数较少(n=4)有关。CUEDC2低表达患者的术后总生存率及无复发生存率均较高表达者显著提升。CUEDC2低表达患者的5年总生存率为54.2%，无复发生存率为39.1%；高表达患者的5年生存率为35.4%，无复发生存率为33.5%。提示CUEDC2参与了肝癌的恶性生物学行为，促进肝癌的病情进展。

表2 影响186例肝癌术后总生存期与无复发生存期的单因素分析

CI: confidence interval; HR: hazard ratio.

表3 影响186例肝癌患者术后总生存期与无复发生存期的Cox模型多因素分析

CI: confidence interval; HR: hazard ratio.

Figure 3.Overall survival (OS) curve (left) and recurrence-free survival (RFS) curve (right) were generated by Kaplan-Meier method. Cumulative survival rates (OS and RFS) in CUEDC2 high expression group were significantly shorter than those in low expression group.

更重要的是Cox多因素回归分析发现，CUEDC2表达状态，术前血清AFP水平、肿瘤数目均是肝癌预后的独立危险因素，提示在Cox多因素回归模型中CUEDC2表达在影响肝癌预后诸因素中的贡献较大，对肝癌具有很好的预后预测价值。

综上所述，CUEDC2在肝癌中存在普遍表达，其表达状态与血清AFP水平、肝癌的大小、数目、分化程度和TNM分期有关，CUEDC2高表达可以作为肝癌预后不良的预测指标，我们的证据提示CUEDC2在肝癌中可能发挥了促癌作用，但是CUEDC2在肝癌形成、发展中的具体功能及分子机制尚需进一步研究。

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Prognostic significance of CUEDC2 expression in hepatocellular carcinoma

WANG Bo-qing1, XUE Feng1, DING Wei1, TANG Jian-jun2, KANG Tie-bang2, MAIMAITI Maolaaisha1, LI Hai-jun1, TANG Jin-tian1, DONG Xiao-gang1, YIN Ji-wei1, ABULA Yimamumaimaitijiang1, YI Chao1, XU Lin1, TONG Qing1, ZHANG Guo-qing1

(1DepartmentofHepatobiliarypancreaticSurgery,AffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthernChina,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060,China.E-mail:dingwei2@medmail.com.cn;zgqprofessor@sina.com)

AIM: To investigate the expression of CUE domain-containing 2 (CUEDC2) in hepatocellular carcinoma (HCC) and to analyze its clinical prognostic significance. METHODS: Total 186 formalin-fixed paraffin-embedded tissues obtained from surgical HCC with detailed clinicopathological and follow-up data were used. The expression of CUEDC2 was detected by immunohistochemistry. The relationships between the expression of CUEDC2 and clinicopathological characteristics and prognosis were analyzed. RESULTS: The positive rate of CUEDC2 in HCC was 85.5% (159/186), among which, the low expression was 52.2% (97/186) and the high expression was 47.8% (89/186). CUEDC2 expression was correlated with serum alpha-fetal protein (AFP) level, tumor size, tumor number, tumor differentiation and TNM stage (P<0.05). Kaplan-Meier survival curves showed that the patients with high expression of CUEDC2 were associated with significantly shorter overall survival and recurrence-free survival than those with low CUEDC2 expression (P<0.05). Multivariate Cox regression analysis revealed 3 independent prognostic factors including CUEDC2 expression, serum AFP and tumor number. CONCLUSION: CUEDC2 was expressed in most HCC tissues, which was relevant to tumor growth, tumor differentiation and prognosis. CUEDC2 could be a novel valuable molecular marker to predict the HCC prognosis.

Liver neoplasms; Hepatectomy; CUEDC2 protein; Prognosis

1000- 4718(2015)01- 0124- 06

2014- 07- 23

2014- 09- 25

新疆医科大学校内重点特色学科项目(No. XYDXK50780306)

△通讯作者 Tel: 0991-7819316； E-mail: dingwei2@medmail.com.cn; zgqprofessor@sina.com

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.024