MG132对高糖条件下肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达及纤维化效应的影响*

石春花， 石明隽， 王圆圆， 刘丽荣， 张昌志， 李 霜， 肖 瑛， 严 瑞， 郭 兵

(贵阳医学院病理生理学教研室，贵州 贵阳 550004)



MG132对高糖条件下肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达及纤维化效应的影响*

石春花， 石明隽△， 王圆圆， 刘丽荣， 张昌志， 李 霜， 肖 瑛， 严 瑞， 郭 兵

(贵阳医学院病理生理学教研室，贵州 贵阳 550004)

目的： 观察蛋白酶体抑制剂MG132对高糖培养条件下肾小管上皮细胞核转录共抑制因子SnoN蛋白表达的影响，探讨MG132减轻高糖状态下肾小管纤维化病变的作用及可能机制。方法：将体外培养的NRK-52E细胞分为正常组(NG)、高糖组(HG)和不同浓度MG132预处理后高糖培养组(HG+MG132)，采用免疫荧光双染的方法观察E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肾小管上皮细胞中的表达和分布，用Western blotting方法检测SnoN、Samd泛素化调节因子2(Smurf2)、Arkadia、E-cadherin、α-SMA和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)等目标蛋白的相对表达量。结果：与 NG组相比，HG组肾小管上皮细胞E-cadherin和SnoN表达减少(P<0.05)，而α-SMA、Col-Ⅰ、Smurf2和Arkadia表达增多(P<0.05)；与HG组相比，不同浓度MG132预处理肾小管上皮细胞后高糖培养，可见肾小管上皮细胞中SnoN和E-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.05)，而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达显著下调(P<0.05)，并且这种效应呈量效依赖性，但MG132预处理对Smurf2和Arkadia的表达无影响。结论：MG132可对抗高糖介导的肾小管上皮细胞的纤维化效应，其机制可能是通过减少SnoN蛋白的泛素化降解作用实现的。

肾小管上皮细胞； 高糖； MG132； SnoN蛋白； Smad泛素化调节因子2； Arkadia蛋白

转化生长因子β1(transformation growth factor-β1，TGF-β1 )/Smad信号通路是目前公认的与肾间质纤维化密切相关的信号通路[1]。转录共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein)可通过多种途径严密地控制着TGF-β1/Smad信号通路的活化水平[2]。本课题组前期研究发现，糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠肾小管上皮细胞中的SnoN蛋白表达减少可能参与了糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发生发展[3]。SnoN蛋白显著减少的机制可能与Smad泛素化调节因子2(Smad ubiquitination regulatory factor 2，Smurf2)和Arkadia等E3泛素连接酶介导其泛素化降解有关[3-5]。Smurf2和Arkadia属于泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)的靶蛋白特异性识别者，可能通过诱导SnoN的泛素化降解从而起到增强TGF-β/Smad信号通路的作用[6]，但具体作用机制有待进一步阐明。MG132具有抑制蛋白酶复合体的活性，进而抑制靶蛋白的降解[7]。因此，本研究采用MG132预处理肾小管上皮细胞后高糖培养，通过抑制蛋白酶体对SnoN蛋白的泛素化降解，进一步研究SnoN在DN病程中的可能作用，并探讨MG132治疗肾小管-间质纤维化的机制。

材 料 和 方 法

1 主要材料与试剂

大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E(复旦大学陆利民教授惠赠)； trypsin胰蛋白酶消化液、两步法免疫组化检测试剂、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司)；I抗稀释液、ECL显色剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI)、牛血清白蛋白、免疫荧光试剂盒-抗兔FITC、免疫荧光试剂盒-抗小鼠Cy3、Western blotting试剂、IP细胞裂解液和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(碧云天公司)；DAB显色试剂盒(博士德公司)；PVDF膜、低糖DMEM培养基、胰酶蛋白、青霉素和链霉素(Hyclong)；胎牛血清(Gibco)；MG132 (Sigma)；rabbit-anti-SnoN、goat-anti-Arkadia、rabbit-anti-E-cadherin(Santa Cruz);mouse-anti-α-SMA、 rabbit-anti-FN、rabbit-anti-Col-I和mouse-anti-β-actin(博奥森公司)；rabbit-anti-Smurf2(Abcam)。其余试剂均为市售分析纯。

2 方法

2.1 NRK-52E细胞株培养和处理 将状况良好的NRK-52E分为细胞正常对照组(NG)：予以0.12‰ DMSO加入DMEM+2% 胎牛血清培养3 h后，换DMEM+2% 胎牛血清培养48 h；高糖对照组(HG)：予以含0.12‰的DMSO加入DMEM+2%胎牛血清培养3 h后，换19.5 mmol/L的D-glucose+DMEM+2%胎牛血清培养培养48 h；高糖MG132处理组(HG+MG132)：以DMSO为溶剂，使MG132终浓度分别为1 μmol/L、2 μmol/L和5 μmol/L，加入DMEM+2%胎牛血清培养3 h后，换19.5 mmol/L的D-glucose+DMEM+2%胎牛血清培养48 h。

2.2 细胞免疫荧光间接双染 将NRK-52E细胞接种至铺有22 mm×22 mm盖玻片的6孔板中，融合度达70%后静止细胞使其同步化生长，PBS漂洗、细胞固定液固定、5% BSA封闭，予E-cadherin(1∶200)和α-SMA(1∶100) 特异性抗体孵育过夜，复温、漂洗，按试剂盒操作指南避光孵育荧光Ⅱ抗及DAPI，漂洗后盖上载玻片，用OLYPUMS-DP72倒置荧光显微镜观察并采集图像。

2.3 Western blotting检测目的蛋白 吸取细胞培养液，生理盐水清洗2次，吸干，6孔板每孔加入含PMSF的细胞裂解液100 μL，用细胞刮刀刮取细胞蛋白。充分裂解后收集到EP管中，12 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，取相应量的上清和2×SDS样本缓冲液配制成统一浓度蛋白样品，混匀后在100 ℃加热10 min，保存于-20 ℃待用，每次用前煮沸3 min，上样、电泳、转膜、封闭，分别孵育特异性抗体过夜，分别为SnoN(1∶200)、Smurf2(1∶600)、Arkadia (1∶300)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶150)、Col-Ⅰ(1∶200)和β-actin(1∶400)，TBST洗膜5 min×3次，孵育特定Ⅱ抗1 h，洗膜后ECL显影曝光，以检测各目标蛋白的相对表达量。

3 统计学处理

所有数据用SPSS 13.0统计软件分析处理，数据用均数±标准差(mean±SD)表示。若数据符合正态分布，通过方差齐性检验，进一步多组比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NRK-52E细胞中E-cadherin和α-SMA的表达和分布

NRK-52E细胞在正常糖环境培养下，细胞胞浆中E-cadherin表达较多，而α-SMA表达极少；相反，在高糖环境培养48 h后，E-cadherin表达明显减少，而α-SMA表达增多，见图1。

Figure 1.Immunofluorescence staining of E-cadherin and α-SMA in NRK-52E cells after 48 h incubated with high concentration of glucose (×200). DAPI staining (blue) represents cell nucleus.

2 MG132对NRK-52E细胞SnoN蛋白表达的影响

与NG组相比，HG组NRK-52E细胞中的SnoN蛋白表达显著减少(P<0.05)；而随着 MG132预处理浓度的增高，HG+MG132组的SnoN蛋白表达较HG组逐渐增多，差异显著(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见图2。

Figure 2.The effects of MG132 on the protein expression of SnoN in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group; △P<0.05 vs HG group; #P<0.05 vs 5 μmol/L MG132+HG group.

3 MG132对高糖培养NRK-52E细胞Smurf2和Arkadia蛋白表达的影响

HG组NRK-52E细胞中的Smurf2和Arkadia蛋白表达较NG组显著增多，差异有统计学意义(P<0.05)；而MG132预处理对高糖环境培养的NRK-52E细胞中的Smurf2和Arkadia蛋白表达没有影响，见图3。

Figure 3.The effects of MG132 on the protein expression of Smurf2 and Arkadia in NRK-52E cells incubated under different conditions. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group.

4 MG132对高糖培养NRK-52E细胞E-cadherin、α-SMA及Col-Ⅰ表达的影响

与NG组比较，高糖显著增加了NRK-52E细胞中α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表达，并降低了E-cadherin表达(P<0.05)；随着MG132浓度的增高，各HG+MG132组NRK-52E细胞中α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表达较HG组显著减少，而E-cadherin蛋白的表达显著增多，差异均有统计学意义(P<0.05)，并呈量效依赖性，见图4。

Figure 4.The effects of MG132 on the protein expression of E-cadherin, α-SMA and Col-Ⅰ in NRK-52 E cells under different conditions. Western blotting was used to determine the expression of E-cadherin, α-SMA and Col-Ⅰ. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group; △P<0.05 vs HG group; #P<0.05 vs 1 μmol/L MG132+HG group; ▲P<0.05 vs 2 μmol/L MG132+HG group.

讨 论

DN是糖尿病常见的慢性微血管并发症，也是糖尿病患者主要的死亡原因，其发病机制尚未充分阐明，且目前缺乏有效治疗措施。随着对DN发病机制研究的深入，肾小管纤维化在其中的作用日益被重视。肾小管上皮细胞向间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肾间质纤维化发生、发展中起重要作用，是肾间质纤维化发生的重要原因[8]。本研究结果显示，高糖培养NRK-52E细胞48 h后，肾小管上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达显著减少，间充质细胞标志性蛋白α-SMA的表达明显增多，并伴有Col-Ⅰ的高表达，表明高糖诱导NRK-52E细胞发生了EMT，同时合成和分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)。

研究表明，高糖能刺激多种细胞因子的分泌和激活，其中，TGF-β1是目前已证实的致肾小管EMT最强的细胞因子之一，在DN肾组织及高糖刺激的肾小管上皮细胞中TGF-β1表达都显著上调，通过TGF-β1/Smads信号通路诱导肾小管上皮细胞发生EMT，进而导致肾小管间质纤维化发生[1, 8]。SnoN作为TGF-β1/Smads信号通路的重要负调控因子，可通过多种机制严密地控制着TGF-β1/Smads信号通路激活[4]，故SnoN的表达水平在很大程度上影响TGF-β1的生物学效应。本课题组前期研究发现，随着DN病程的进展，肾小管上皮细胞中SnoN蛋白的表达显著减少，TGF-β1、Smad2/3及 Smurf2的表达持续增多，但SnoN mRNA较正常组却无明显差异，故推测DN病程中SnoN蛋白的减少可能是由于Smurf2等E3泛素连接酶介导其泛素化降解的结果[5, 9]，而不是由转录水平的下调引起的。也有研究发现，体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞中SnoN蛋白的表达减少，E3泛素连接酶Arkadia的表达增高[10]，在阻塞性肾病模型中SnoN蛋白随着病程进展显著减少， E3泛素连接酶Smurf2的表达增多[4]，均表明SnoN蛋白的表达下调可能与泛素-蛋白酶体激活有关。本研究结果显示，高糖条件下NRK-52E细胞中Smurf2和Arkadia的表达增多，而SnoN蛋白的表达则显著减少。结合我们课题组和其他学者的研究结果[5, 10]，进一步提示SnoN蛋白的减少可能是由于泛素-蛋白酶体激活增强对其泛素化降解所致。由于SnoN的减少，失去了对TGF-β1/Smads信号通路的控制，使其致纤维化效应级联放大[4-5, 10]， E-cadherin表达下调，α-SMA和Col-Ⅰ表达增多，促进了肾小管间质纤维化的发生发展。而通过上调SnoN蛋白的表达，能够抑制TGF-β1/Smads信号通路介导α-SMA、FN等靶基因的表达[4]，减轻纤维化病变。因此，恢复内源性SnoN蛋白表达水平成为防治DN的研究重点。

MG132是一种醛基肽类化合物的蛋白酶体抑制剂，能与蛋白酶体结合，可逆性地抑制蛋白酶体的活性，进而抑制靶蛋白的降解[7]。近年研究证实，MG132可通过多种途径抑制心、肺等脏器纤维化的发生[11-12]，尤其在对抗氧化损伤、炎症浸润、纤维化病变方面具有较好作用[13-14]。鉴于DN病程中SnoN蛋白表达减少可能是由于泛素-蛋白酶体活性增强对其降解所致，所以我们设想：是否可通过抑制蛋白酶体系统的活性，减少SnoN蛋白的降解，从而延缓或逆转DN纤维化进程。因此，本研究予不同浓度MG132预处理NRK-52E细胞后高糖培养，结果显示MG132能显著对抗高糖诱导的SnoN蛋白降低，恢复NRK-52E细胞中SnoN蛋白的表达，并使E-cadherin蛋白表达上调，而α-SMA、FN和Col-Ⅰ蛋白表达下调，而且这种效应呈量效依赖性。但是，MG132对高糖条件下肾小管上皮细胞的Smurf2和Arkadia表达水平没有影响。上述研究结果表明，MG132恢复高糖条件下肾小管上皮细胞中SnoN蛋白的表达不是通过减少E3泛素连接酶Smurf2和Arkadia的表达水平，而是通过抑制蛋白酶体对SnoN蛋白的降解，恢复内源性SnoN蛋白表达，进而在胞浆和胞核发挥限制TGF-β1/Smads信号转导的作用，延缓或阻断DN肾小管EMT的发生和ECM的合成，进而抑制了肾小管间质纤维化的发生发展。

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Effects of MG132 on protein expression of SnoN and fibrosis- related indicators in NRK-52E cells after incubated with high concentration of glucose

SHI Chun-hua, SHI Ming-jun, WANG Yuan-yuan, LIU Li-rong, ZHANG Chang-zhi, LI Shuang, XIAO Ying, YAN Rui, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.E-mail:smjtyf@126.com)

AIM: To investigate the effects of proteasome inhibitor MG132 on the expression of SnoN in renal tubule epithelial cells incubated in high glucose, and to explore the possible mechanism and function that MG132 reduces or slows down renal tubular interstitial injury after incubated in high glucose. METHODS: The NRK-52E cells were divided into normal control group (NG), high glucose group (HG) and high glucose plus pretreatment with different doses of MG132 group (HG+MG132). The immunofluorescence staining was used to detect the protein expression of E-cadherin and α-smooth muscle actin (α-SMA) in NRK-52E cells under different conditions. The relative protein expression levels of SnoN, Smad ubiquitination regulatory factor 2 (Smurf2), Arkadia, E-cadherin, α-SMA and collagen type Ⅰ(Col-Ⅰ) were detected by Western blotting. RESULTS: Compared with NG group, the expression of E-cadherin and SnoN was decreased (P<0.05), while the expression of α-SMA, Col-Ⅰ, Smurf2 and Arkadia was increased (P<0.05). Compared with HG group, the protein expression of SnoN and E-cadherin was significantly up-regulated in HG+MG132 group (P<0.05), and the protein expression of α-SMA and Col-Ⅰ was significantly down-regulated in a dose-depended manner (P<0.05). However, no effect on the protein expression of Smurf2 and Arkadia was observed. CONCLUSION: MG132 inhibits the degradation of SnoN protein induced by high glucose, thus reducing the renal fibrosis.

Renal tubular epithelial cells; High glucose; MG132; SnoN protein; Smad ubiquitination regulatory factor 2; Arkadia protein

1000- 4718(2015)01- 0064- 05

2014- 08- 12

2014- 10- 08

国家自然科学基金资助项目(No.81160094)；贵州省优秀科技教育人才省长专项基金资助项目(黔省专合字[2010]40号)；贵阳医学院青年基金资助项目(No. k2007-13)

△通讯作者 Tel: 0851-6908348; E-mail: smjtyf@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.013