自然杀伤细胞及其受体与结核病研究进展

孟祥红，程小星

自然杀伤(natural killer，NK)细胞是参与机体固有免疫的重要细胞。NK细胞的激活不受主要组织相容复合物(majar histocompatibility complex，MHC)限制，不依赖抗体，可非特异性地识别靶细胞，产生细胞毒作用破坏溶解靶细胞、分泌细胞因子和趋化因子控制病原微生物的感染。NK细胞同时也是参与获得性免疫的重要细胞［1］，在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节方面发挥重要作用［2］。近年来随着对抗结核感染固有免疫机制的深入研究，NK细胞的重要作用越来越引起重视。现将NK细胞及其受体(NKR)在结核病中的作用进行综述。

1 结核分枝杆菌感染与固有免疫

结核病是引起死亡人数高居第2位的感染性疾病。由于艾滋病病毒(HIV)的感染流行、耐药结核的产生、人口流动和免疫抑制剂的应用增多等原因，全球结核病疫情非常严重，仅2012年，全球新发结核病例860万，有130万人死亡，约45万人为耐多药结核病［3］。我国现有活动性肺结核患者约500万，每年约有13万人死于结核病。据世界卫生组织调查结果显示，目前结核感染的人数占世界人口的1/3，结核病已经成为全球重大的公共卫生问题。尽管受结核菌感染人数众多，仅有5% ～10%的感染者发展成为活动性结核病［4］。研究结果表明，结核病的发生、发展和转归不仅取决于结核分枝杆菌的数量和毒力，在很大程度上还取决于宿主的免疫状态［4-5］。

结核病是由结核分枝杆菌(Mtb)所致的慢性传染病，Mtb致病性菌体物质主要为脂质、蛋白质和多糖。脂质中的磷脂能够刺激机体内单核细胞的增殖并使炎症中的巨噬细胞转为类上皮细胞而形成结核结节，蜡质D是分枝菌酸和肽糖脂复合物，具有佐剂活性，参与迟发型超敏反应;菌体蛋白可与蜡质结合成为完全抗原，使机体发生超敏反应。多糖是结核杆菌菌体完全抗原的主要组成成分，具有佐剂活性，可引发嗜中性粒细胞的化学趋向反应。既往普遍认为，由于Mtb是胞内菌，因此由T细胞介导的细胞免疫在抗结核感染免疫中发挥核心作用。近年来的免疫学和遗传学研究结果表明，固有免疫在结核免疫中同样发挥重要作用，有部分长期与活动性肺结核患者密切接触的健康人群结核菌素(PPD)试验结果却为阴性，其原因可能是机体感染了Mtb后，固有免疫发挥了重要作用，而细胞免疫并未启动。近年来固有免疫在抗结核感染中的作用已经日渐受到关注。固有免疫和获得性免疫共同参与抗结核感染免疫［6］。固有免疫是构成机体抵御病原生物入侵的第一道防线，同时也是获得性免疫激发的基础。在病原菌入侵宿主的早期，固有免疫系统对于病原体的控制和清除过程发挥着重要作用。固有免疫系统由NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性白细胞等及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素(IL)-10、IL-12等细胞因子和补体蛋白组成。它们无需抗原预先致敏，主要通过释放穿孔素、脱颗粒酶、表达配体和分泌干扰素等发挥作用，杀伤靶细胞。固有免疫在结核感染的早期发挥抗感染作用，而且对于激发宿主获得性免疫也发挥了重要作用［7-8］。NK细胞是固有免疫的主要效应细胞，其激活不受MHC限制，不依赖抗体，可快速募集到感染部位，非特异性地识别被感染的靶细胞，产生细胞毒作用破坏溶解靶细胞，同时发挥免疫调节作用，NK细胞也是参与获得性免疫的重要细胞，在抗感染免疫中发挥重要作用。NK细胞抗结核杆菌的免疫机制还有待于进一步研究。

2 NK细胞表型及在结核感染中的变化特点

NK细胞源自骨髓造血干细胞，成熟NK细胞主要分布于淋巴器官和血液循环系统。在人外周血中，NK细胞占单个核细胞的5% ～20%。NK细胞表型为 CD3－CD56+，通常依据细胞的表面标志CD56和CDl6表达水平不同将NK细胞分成两个亚群:CD56highCD16+/－和 CD56dimCD16+，它们分别具有不同的功能特点。CD56dimCD16+NK细胞是主要分布于外周血和炎性组织内，表达CXCR1、CX3CR1和ChemR23趋化因子受体，受体表型为 CD16+KIR+/NKG2A+，通常认为它具有强大的细胞毒作用，基本不分泌细胞因子。而CD3－CD56highNK细胞则主要分布在淋巴结中，受体表型为CD16－KIR－NKG2A+，具有分泌细胞因子的功能，可分泌IFN-γ、IL-10、IL-13、TNF-α和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子，可提高巨噬细胞抑制病原生物增殖的程度和吞噬病原生物的能力，其细胞毒性作用则不常见［9-10］。近年来研究发现，在NK细胞活化的早期，CD3－CD56dimCD16+NK细胞一方面具有强大的细胞毒作用，还可分泌大量的IFN-γ，促进单核(巨噬细胞)系统的活化以及CD8+细胞增殖和分化，增强免疫系统的细胞毒作用［11-12］。

随着结核免疫研究的深入，NK细胞抗结核的免疫机制受到广泛关注。目前研究结果表明，结核病中NK细胞的活性受抑，而且发现在结核患者中NK细胞的分布、表型也存在改变，但研究结果差别很大。Ota等［13］发现，与健康对照者相比，肺结核患者胸腔积液中NK细胞的杀伤细胞活性升高。Nirmala等［14］报道结核感染和TB、HIV共感染人群的外周血NK细胞数量及相对比例与健康对照者比较没有明显区别，但NK细胞的活性呈明显下降。Deveci等［15］在研究中发现，与健康对照者比较，活动性肺结核患者的外周血中CD3－CD16+CD56dimNK细胞的比例明显上升。与之结果相反，Barcelos等［16］报道肺结核患者外周血中 CD3－CD16+CD56dimNK细胞的比例较PPD试验阴性健康对照者降低，同PPD试验阳性的健康对照者比较则未见明显差异。Schierloh等［10］发现，肺结核患者胸腔积液中的CD56highNK细胞比例增加，CD56dimNK细胞和穿孔素的表达下降。上述报道中有关外周血中NK细胞数量、比例分布不一的结果可能与研究对象的例数较少、未排除患者病情、疗程及并发症等影响免疫功能的因素有关。结核病患者中NK细胞的活性受抑表明其在抗结核免疫中发挥重要作用，但是在结核感染中NK亚群分布特点及比例还有待进一步研究。

3 NK细胞抗结核感染机制

NK细胞主要通过细胞毒活性和分泌细胞因子而发挥杀伤细胞和免疫调节作用。NK细胞可非特异性地识别被病原微生物感染的单核、巨噬细胞，通过分泌穿孔素和颗粒酶发挥细胞毒作用;同时通过分泌大量IFN-γ等细胞因子及趋化因子的受体、黏附分子受体来控制病原微生物感染。

抗结核感染中，NK细胞可被Mtb特异性抗原诱导活化发挥杀细胞作用，其中toll样受体(toll like receptors，TLR)发挥了重要作用。TLR是一类跨膜受体，属于模式分子识别受体(PRR)，在多种免疫细胞上表达，如NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、噬碱细胞、嗜酸细胞、树突状细胞(DCs)等，通过识别并结合相应的模式分子(PAMP)诱导、活化免疫细胞，在抗感染免疫中发挥重要作用。当机体感染了Mtb后，TLR识别Mtb属细胞壁成分如PAMP启动细胞内的信号转导，诱导细胞因子表达，募集多种固有免疫细胞到病变部位，不仅发挥激活固有免疫细胞、杀伤Mtb的作用，而且在肉芽肿形成和抗结核感染获得免疫中发挥重要作用。目前已知TLR家族中主要有TLR2、TLR4和TLR9参与抗结核菌感染。在Mtb感染早期，人类NK细胞通过TLR2直接识别 Mtb，分泌 IFN-γ 和 TNF-α，迅速、直接发挥抗结核免疫的功能［17］。

NK细胞通过细胞毒作用和分泌大量可溶性细胞因子如IFN-γ、TNF-α等杀灭被Mtb感染的单个核细胞和巨噬细胞以及抑制Mtb在巨噬细胞内繁殖［18］。IFN-γ 可激活巨噬细胞，产生过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)等物质杀灭寄生在巨噬细胞内的Mtb。NK细胞被lL-12激活后，培养上清液可明显抑制 Mtb在巨噬细胞内的复制［19］。TNF-α还可通过诱导巨噬细胞凋亡来清除胞内感染的Mtb，提高巨噬细胞的吞噬能力，增强对Mtb的杀伤力。TNF-α与INF-γ协同作用活化巨噬细胞，促进吞噬溶酶体的形成、成熟及刺激活性氮介质产生，共同控制和杀灭Mtb［20］。NK细胞产生的IL-22通过增强吞噬溶酶融合而抑制Mtb在巨噬细胞内的增殖。Dhiman等［21］发现 IL-22可促进 NK细胞产粒溶素增加，杀伤Mtb感染的巨噬细胞。

4 NKR与抗结核感染

4.1 NKR分类 NK细胞通过抑制型和激活型两类受体识别靶细胞表面的MHC-Ⅰ，通过传递活化或者抑制信号调节NK细胞的细胞毒活性。虽然目前发现NK细胞表面标志很多(表面受体或表面抗原、分子等)，但多为与其他免疫细胞共有，自身没有特异性受体。根据NKR的功能不同，可分类为活化型受体和抑制型受体;按照受体的配体是否为MHC-Ⅰ类分子，可归类为MHC-Ⅰ类分子受体和非MHC-Ⅰ类分子受体;根据受体结构不同可分为:杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，属于免疫球蛋白超家族成员(Ig-SF);C型凝集素样受体(C-type lectin receptor，CLR)，包含1个或多个C型凝集素样结构域，主要为CD94/NKG2家族;免疫球蛋白样转录物(immunoglobulin-like transcript，ILT)，该受体家族主要有 ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT7、ILT8 等亚型。KIR家族、CLR和ILT家族中均分别包含活化型和抑制型受体。活化型受体的共同特点是:胞浆区含有免疫受体酪氨酸活化性基序(immunoreceptortyosine-based activation，ITAM)。抑制型受体的共同点是:受体分子的胞外区结构域可以识别自身的MHC-Ⅰ类分子，同时胞浆区至少含有一个免疫受体酪氨酸抑制性基序(immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif，ITIM)。正常情况下，NK细胞抑制性受体识别正常细胞表面MHC-Ⅰ类分子，向NK细胞传递抑制信号，抑制NK细胞保护正常细胞不被NK细胞杀伤。当病原体感染靶细胞后，其细胞表面的MHC-Ⅰ类分子发生变化，NKR不能与之结合，导致NK细胞活化信号增强，杀伤被感染的靶细胞。

4.2 NKR及其抗结核感染

4.2.1 KIR家族:人类 KIR基因位于染色体19q13．4，目前已知KIR家族共有19个基因型，主要识别 HLA-A、HLA-B和 HLA-C分子。KIR2DS1-KIR2DS5、KIR3DS1及 KIR2DL4为活化型受体，KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3为抑制型受体。KIR参与结核病发生。Habegger等［22］对35例结核患者进行HLA分子检测，发现在结核患者中KIR2DL3-HLA-C1显著表达。NKp46属于KIR家族的激活性受体，可激活NK细胞对多种靶细胞发生细胞毒作用。Vankayalapati等［23］报道，在NKp46受体作用下，NK细胞可裂解结核菌感染的单核细胞和肺泡巨噬细胞。

4.2.2 CLR:人类CLR多达60种，主要包括Ly49、CD94/NKG2A和NKG2D等。Ly49分子包括抑制性和激活性受体，其中 Ly49A、B、C、E、F、G、I、Qd 等为抑制性受体，小鼠的 Ly49D、Ly49H、Ly49P、Ly49L 属于激活性NKR。Ly49分子大部分识别MHC-Ⅰ类分子，而Ly49H与鼠巨细胞病毒感染细胞表面的病毒糖蛋白m157具有高亲和力。NKG2A与CD94结合形成异二聚体，在NK细胞表面表达为抑制性受体，可负调节NK细胞功能，促使巨噬细胞逃逸NK细胞介导固有免疫。NKG2D属于激活性受体，可与HLA-A和HLA-B类分子及部分U16蛋白结合，激活NK细胞，杀伤结核菌感染的靶细胞。

4.2.3 ILT:ILT属于免疫球蛋白超家族一员，是新发现的一类HLA-Ⅰ类受体家族，又称白细胞免疫球蛋白样受体(leucocyte Ig-like receptor，LIR)或者CD85。人类 ILT 位于人染色体 19q13．2 ～13．4，按照功能将ILT分为抑制性(主要为ILT2、ILT3、ILT4、ILT5等)受体和激活性受体(主要为 ILT1、ILT7、ILT8等)两类，既有负性调节又有正性调节作用。ILT与KIR具有亲缘性，ILT表达则更为广泛，可在T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞表面表达各不相同的受体类型，通过转导抑制性或激活性信号发挥广泛的免疫调节作用。

ILT2(又称 CD85j、LILRB1、LIR-1)作为 ILT 家族中的重要成员，属于免疫球蛋白超家族1型跨膜受体蛋白，分子量为110 kD，胞质内含有4个ITIMs，属于抑制性受体，该受体通过动员Src同源结构域(SH2)蛋白如SHP参与ITIMs酪氨酸磷酸化的负信号调节［24］。ILT2能结合经典及非经典的HLA分子，包括 HLA-A、-B、-C、-E 和-G，同时，ILT-2 还能识别病毒蛋白如与人类CMV(HCMC)编码MHC-Ⅰ类分子的同源分子UL18蛋白以抑制效应细胞的活性［25］，在 T细胞、B 细胞、NK 细胞、单核细胞和树突状细胞上广泛表达。ILT2受体与抗体发生交联可激发抑制信号，减低CD8 T细胞的细胞毒活，阻断ILT2信号通路可加强CTL细胞的溶细胞作用［26］。ILT2抑制T细胞的功能是通过抑制TCR和T细胞活化衔接因子(linker for activation of T cells，LAT)磷酸化和抑制肌动蛋白细胞重排实现的。另一方面，据相关报道，CD8+T细胞上的ILT2可与人类巨细胞病毒HCMC的蛋白UL18发生特异性反应，介导非 MHC限制的 HCMC感染细胞的裂解［27-28］。Scott Algara等［29］发现ILT2+NK细胞可有效地控制HIV-1在单核细胞衍生的树突状细胞(MDDCs)中的复制。Arnold等［30］发现 ILT2可与非 HLA-I型配体-S100蛋白家族中的一种钙结合蛋白S100A9相互作用，增强NK细胞抗HIV-1感染的活性。

ILT2作为一种免疫抑制分子，在抗病毒、抗肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植耐受领域已经有相关研究，但对于ILT2在结核免疫中的作用研究很少。有学者对艾滋病(结核病)患者NK细胞上ILT2的表达进行相关研究，并与健康对照组比较，在艾滋病和艾滋病合并结核感染患者中，ILT2在CD3－CD56+NK细胞上表达水平升高，但在CD3－CD16+NK细胞表达上无差别;而在单独肺结核感染患者中，ILT2在两种NK细胞亚型细胞上的表达均降低，由于研究对象例数过少，并未进行ILT2的功能研究［31］。笔者所在课题组对70例活动性肺结核患者外周血NK细胞上ILT2的表达进行研究发现，ILT2在活动性肺结核患者外周血 CD56dimCD16+NK细胞表达比例明显高于健康对照者，且表达水平与肺结核病的病情严重程度呈正相关;对ILT2的功能研究发现，ILT2在CD56dimNK细胞的表达与NK细胞的细胞毒作用缺陷和产生IFN-γ降低相关，通过阻断ILT2信号通路可提高CD56dimNK细胞的细胞毒作，同时还发现ILT2可促进活动性肺结核患者CD56dimNK细胞的自然凋亡［32］。

5 结语

NK细胞及NKR在抗结核固有免疫中显示出重要作用。NK细胞及不同亚群表达一系列激活或抑制性受体，两种受体之间的平衡是调控NK细胞是否被激活发挥抗感染免疫功能的重要机制。ITL2作为新发现的一类的 NK细胞抑制性受体，在CD56dimNK细胞上的表达水平与肺结核病的病情严重程度相关，可通过下调肺结核患者CD56dimNK细胞的功能及促进CD56dimNK细胞的自然凋亡而参与结核免疫。进一步研究NK细胞在结核病中的变化及机制，设计与之相关的拮抗剂，将为结核病的防治提供新思路。

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