益肾方对db/db糖尿病小鼠肾保护作用的疗效观察

邓丽娥, 卢汉祺, 董晶晶, 李云逸, 姚淑焕, 洪嘉玲, 林捷, 范丽静, 曹锐, 董向楠, 卢永平, 叶明君, Bernhard Krämer, Berthold Hocher, 尹良红, 李强*

(1.东莞市中医院 内十科, 广东 东莞 523000; 2.暨南大学 附属第一医院 肾内科， 广东 广州 510630;3.德国海德堡大学 蔓海姆医学院 肾脏病医院, 德国 海德堡市 69117)

全球成人糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率已从1980年的4.7%上升至2014年的8.5%[1]，据预测2035年全球糖尿病患病人数可能会超过5.919亿，成为一场严重的国际健康危机[2].糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是常见的糖尿病微血管并发症之一，严重地影响糖尿病患者的生活质量及平均寿命.在中国，DKD是继肾小球肾炎之后引发终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD)的第二大病因.该病发病机制复杂，目前认为与长期血糖控制欠佳致肾脏内胰岛素信号转导异常、终末期糖基化产物大量堆积、肾脏血流动力学改变、炎症状态、氧化应激以及遗传等因素密切相关[3].DKD早期表现并不显著，临床发现率较低；进入DKD Ⅲ期后，患者会出现尿微量白蛋白排泄率持续增加、血压升高、肾小球滤过率下降的症状，并逐渐加重，直至进入终末期.在延缓DKD进程中，西医通过饮食调整、控制血糖血压血脂、抗感染抗氧化、降低尿蛋白等措施进行干预[4]，但每年依然有大量患者不可逆地进入DKD终末期[5].中医疗法在DKD临床治疗上具有一定的优势[6-9]，益肾方具有“健脾益肾、通利活血”的功效，在保护糖尿病患者肾脏功能、缓解患者临床症状、提高其生活质量、甚至推迟进入ESRD需肾脏替代治疗的时间等方面有明确疗效.本研究通过观察益肾方对糖尿病肾病小鼠血糖、尿微量白蛋白和肾脏病理改变的影响，探讨益肾方对DKD的防治作用，为其临床应用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只6周龄无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级雄性db/db糖尿病小鼠(Lepr)ko/ko和15只同背景雄性(Lepr)db/m小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，生产许可证：SCXK(苏)2015-0001，体质量22～50 g.动物饲养于暨南大学动物实验中心SPF级动物房.每天进食量为4～6 g，自由饮水，12 h光暗循环，室内保持恒温(24±1)℃，恒湿(45±10)%.

1.2 药物、主要材料和试剂

益肾方水煎液和洛汀新由东莞市中医院提供，益肾方配方：黄芪30 g、山茱萸15 g、柴胡10 g、当归10 g、菟丝子20 g、僵蚕15 g，上述药物加入5倍量蒸馏水煎煮30 min，煎煮2次，过滤，滤液(水煎液)浓缩到200 g于4 ℃冰箱存储备用.洛汀新(10 mg·kg-1)混悬液配制：每500 mL生理盐水中加入500 mg药物混匀后常温保存备用.血糖试纸和血糖仪购于德国拜尔公司.用于检测血清胱抑素C、尿微量白蛋白、尿肌酐的Elisa试剂盒均购自广州赛国生物科技有限公司.苏木素-伊红染色试剂盒和PAS染色试剂盒均购自武汉塞维尔生物科技有限公司.

1.3 实验分组

①正常对照组：15只同背景db/m小鼠，10 mL·kg-1·d-1生理盐水灌胃12周；②模型组：15只db/db 小鼠，10 mL·kg-1·d-1生理盐水灌胃12周；③益肾方低剂量组：15只db/db糖尿病小鼠，2.4 g·kg-1·d-1益肾方灌胃12周；④益肾方高剂量组：15只db/db糖尿病小鼠，5.0 g·kg-1·d-1益肾方灌胃12周；⑤洛汀新组：15只db/db糖尿病小鼠，10 mg·kg-1·d-1洛汀新灌胃治疗12周.db/db糖尿病小鼠采用抽签随机分组法.小鼠进入动物房环境适应1周后即小鼠第7周龄开始灌胃，每日1次.其中，益肾方低剂量组及洛汀新组小鼠的灌胃量为根据人与动物的体表面积计算得出，益肾方高剂量组的灌胃量约为益肾方低剂量组的2倍.

1.4 样本采集与处理

实验结束后使用代谢笼收集各组小鼠的24 h尿液并记录，-80 ℃冰箱保存，用于后续检测.实验结束后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各组小鼠，摘眼球采血，4 ℃静置，3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，-80 ℃冰箱保存备用.迅速打开腹腔，取出肾脏组织，去除包膜，于4%多聚甲醛固定液保存用于肾脏病理学观察.

1.5 指标检测

1.5.1 血糖仪检测空腹血糖

应用快速血糖仪检测小鼠空腹8 h尾静脉血糖浓度，每4周1次.

1.5.2 Elisa法检测生化指标

代谢笼收集尿液迅速将标本放置-80 ℃冰箱存储.检测前常温下解冻，离心后取上清液按照Elisa试剂盒说明书测定尿微量白蛋白、尿肌酐水平.小鼠眼眶采血，分离动物血清，按照Elisa试剂盒的操作说明检测小鼠血清胱抑素C水平.

1.5.3 病理学观察

去除包膜的肾脏组织切成薄片，4%多聚甲醛固定24 h，自来水洗净残留固体成分，修整使切面平整，再以75%(过夜)、85%(2 h)、90%(2 h)、95%(1 h)及100%乙醇(30 min×2)顺序梯度脱水，二甲苯(3次，每次5～10 min)透明，石蜡包埋后进行修整、切片(厚度约4 μm)，摊片后于60 ℃烘箱内烘烤，室温保存.进行苏木素-伊红(HE)染色和PAS染色，光镜观察肾组织的病理学变化.组织病变程度采用五级分法，无病变或极少量病变计分为0；有轻度病变或少量病变计分为1；有中度病变或中等量病变计分为2；有重度病变或多量病变计分为3；有极重度病变或大量病变计分为4.

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

正常对照组小鼠皮毛光滑，反应灵活，神情自如，进食、饮水、大小便正常；模型组小鼠皮毛干涩，活动少，易怒，精神差，进食量减少，小便量增多，体质量减轻；益肾方低剂量组、益肾方高剂量组、洛汀新组药物干预后小鼠精神稍好转，反应较模型组灵敏，恢复最明显的为益肾方高剂量组.提示益肾方对db/db糖尿病小鼠临床症状的改善作用.

2.2 各组小鼠生化指标比较

与正常对照组相比，模型组小鼠血糖、尿肌酐/尿微量白蛋白比值(ACR)、尿微量白蛋白、胱抑素C明显升高(P<0.05)，提示肾功能出现损害.与正常对照组相比，模型组、益肾方低剂量组、益肾方高剂量组及洛汀新组的血糖均显著增高(P<0.05)；与模型组相比，益肾方低剂量组、益肾方高剂量组及洛汀新组的血糖无显著差异.与正常对照组相比，模型组、益肾方低剂量组、益肾方高剂量组及洛汀新组的尿微量白蛋白、ACR均显著增高(P<0.05)；益肾方及洛汀新治疗后ACR显著下降(P<0.05)，且益肾方高剂量组的ACR较益肾方低剂量组及洛汀新组下降更为明显(P<0.05).与正常对照组比较，模型组、益肾方低剂量组、益肾方高剂量组及洛汀新组的胱抑素C显著增高(P<0.05)，益肾方低剂量组、益肾方高剂量组和洛汀新组的胱抑素C水平较模型组下降(P<0.05)，且益肾方高剂量组胱抑素C水平下降最为明显(P<0.05，表1).上述结果提示益肾方对db/db糖尿病小鼠生化指标的改善作用呈剂量依懒性，且可能独立于血糖水平.

表1 组间生化指标比较Table 1 Comparison of biochemical indicators between groups

2.3 各组大鼠肾脏病理形态学改变

HE染色结果显示，正常对照组小鼠肾脏组织结构较清晰，肾小球无坏死，肾小管无萎缩，间质无明显炎症及渗出；模型组小鼠肾脏组织结构主要病变在肾小球系膜区及肾小管，肾小球系膜区可见系膜细胞增生，并可见灶性球囊粘连、节段硬化等病变出现，可见多处灶性肾小管上皮刷状缘脱落、上皮细胞极度扁平、管腔扩张、肾小管基底膜增厚(其被定义为肾小管急性病变)；益肾方低剂量组、益肾方高剂量组及洛汀新组的上述病理变化明显减轻.分别对各组肾小球系膜区增生、肾小管上皮细胞变性、肾小管扩张、间质炎症等病理形态进行评分，与正常对照组比较，模型组、益肾方低剂量组、益肾方高剂量组及洛汀新组中肾小球系膜基质变化评分、肾小管急性病变程度评分、肾小球上皮空泡样变性评分明显增加(P<0.05)；而益肾方低剂量组、益肾方高剂量组及洛汀新组治疗后上述病理评分明显降低(P<0.05)，且益肾方高剂量组的上述病理评分降低最显著(P<0.05，表2).

表2 肾脏病理组织评分比较Table 2 Comparison of kidney pathological tissue scores 分

A: HE染色结果；b:PAS染色结果. A：正常对照组；B：模型组；C：益肾方低剂量组；D：益肾方高剂量组；E：洛汀新组.

A：正常对照组；B：模型组；C：益肾方低剂量组；D：益肾方高剂量组；E：洛汀新组.A: Control group; B: Model group; C: Low-dose group of Yishen Recipe; D: High-dose group of Yishen Recipe; E: Lotensin group.

从图1中可以观察到肾小球的改变，模型组小鼠肾小球基底膜增厚，系膜区无细胞结构样增生明显，球袢缺血皱缩并出现部分球囊粘连及节段硬化；洛丁新组基底膜厚度较模型组无明显改变，但未出现节段硬化及球囊粘连现象，系膜区增宽现象减轻；益肾方低剂量组及高剂量组均未出现节段硬化及球囊粘连现象，基底膜厚度增生情况减轻，未出现球袢缺血皱缩现象，系膜区增生现象明显减轻.从图2中可以观察到肾间质及肾小管的改变，各组小鼠肾间质均未出现纤维化，模型组小鼠肾间质出现单个核细胞浸润，其余各组均未出现；肾小管方面改变，模型组、洛丁新组、益肾方低剂量组小鼠均出现部分肾小管刷状缘脱落、上皮细胞极度扁平、再生上皮细胞排列紊乱现象，紊乱程度：模型组>洛丁新组>益肾方低剂量组，而益肾方高剂量组肾小管刷状缘保存完好，并未出现肾小管上皮细胞损伤.提示益肾方对肾脏具有保护作用.

3 讨论

DKD是糖尿病常见的微血管并发症，也是导致终末期肾病的主要原因之一[10].据统计，我国成年人糖尿病的患病率从2007年的9.7%上升到2017年的11.2%[11]，糖尿病患者并发肾脏并发症的患病率高达41.4%[12].可见，DKD已经成为严重的公共卫生问题，寻找有效的干预措施具有重要意义.本研究首先在DKD小鼠模型上探讨益肾方的疗效，重点观察其对db/db糖尿病小鼠肾脏病理变化的影响.db/db糖尿病小鼠是自发2型糖尿病小鼠，在其自然生长过程中，约5～6周龄可出现血糖升高，8～10周龄出现肾功能损伤，已被广泛应用于DKD的研究工作中，可作为DKD的理想模型.从本研究中可以看出，模型组小鼠肾小球基底膜增厚，系膜区无细胞结构样增生明显，球袢缺血皱缩并出现部分球囊粘连及节段硬化，虽未出现明确的肾纤维化，但可作为其前期病理改变.

中医学将DKD归于消渴范畴，认为禀赋不足、饮食不节、劳欲太过、情志失调等，可导致肾脏亏虚，气化失司，发为本病.基本病机为本虚标实，虚实夹杂；虚为脾肾虚损，标实为气郁、瘀血、痰湿、浊毒.消渴病若失治误治，病情逐渐发展可影响到肾脏，导致脾肾两虚.脾虚摄纳无力，肾虚封藏无权，人体精微流失加重，表现为蛋白尿持续增加.糖尿病的病情进展至DKD阶段，已是五脏穷极，必归于肾，本虚是必然的.所以，DKD大都以脾伤及脾虚为起始，后期波及肾脏[13]，脾气虚不摄精，肾气虚不藏精，精微下泄，气血不行，气络郁滞，导致津血运行不畅，化为痰瘀，湿、瘀、痰、滞相互为患，胶结于肾之络脉中，推进了DKD的发展.治疗当以健脾补肾为主，祛邪以通利活血为重.

益肾方是东莞市中医院何世东教授长期治疗DKD的经验总结，50余年的临床实践表明，益肾方治疗DKD疗效确切，在保护患者肾功能、推迟进入肾脏替代的时间、缓解患者临床症状、提高其生活质量方面有显著疗效.益肾方全方由黄芪、山茱萸、菟丝子、当归、僵蚕组成.方中以黄芪为君药，味甘，性微温，补益肺、脾、肾之阳气，使脾肾之气健旺，脾能摄、肾能固，则精微下泄能止；山茱萸、菟丝子益阴固精为臣，配合黄芪，一阴一阳，阴阳相合，相互促进，相互转化，共奏健脾肾、敛脾精、止漏浊之功；佐以当归，取“有形之血不能速生，无形之气应当急固，补气方能生血”之义，行益气活血之效；僵蚕取其清扬之性，透表利于外邪之疏散，疏泄利于湿毒之蠲除，与柴胡共为使药，轻清升散，疏利三焦，使邪有出路，枢机运转，有利于脾肾同补，全方共奏益肾健脾、通利活血之功.研究显示，黄芪的主要活性成分黄芪甲甙及黄芪多糖可通过延缓DKD小鼠的肾纤维化进程，减少蛋白尿，保护肾脏功能[14]；当归的活性成分当归多糖可通过调节TLR4/NF-κB信号通路降低DKD大鼠肾脏的炎症水平，延缓肾纤维化进程[15]；山茱萸颗粒可抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制YKL-40表达，改善DKD大鼠的肾脏损伤[16];僵蚕可通过抑制肾脏组织中TLR4及TGF-β1的表达改善慢性肾炎大鼠肾脏的病理变化，降低血脂，减轻蛋白尿，延缓疾病进程[17]；菟丝子中的有效活性成分异鼠李素可减轻糖尿病大鼠的足细胞损伤，改善肾脏病理变化，其作用机制可能与增加肾脏的自噬有关[18]；柴胡的主要成分柴胡皂苷可增强高糖状态下肾小管上皮细胞的抗氧化能力、减轻氧化应激反应，有效改善糖尿病大鼠的肾脏结构和功能损伤[19].上述研究提示，益肾方对DKD的潜在治疗作用.

本研究通过db/db糖尿病小鼠成功构建DKD模型，结果提示低剂量跟高剂量益肾方均具有肾脏保护作用，其作用可能是通过降低肾小球系膜外基质，减轻肾小球基底膜增厚、肾小球管腔扩张.DKD归途是由肾脏纤维化进展至肾功能衰竭，而肾脏纤维化的病变特征是大量的炎性细胞浸润、肾小管萎缩、间质肌成纤维细胞激活及其导致的细胞外基质成分过度堆积，最终取代正常的肾脏结构、形成瘢痕，造成肾脏功能的丧失与衰竭[20].本研究显示，益肾方低剂量组、益肾方高剂量组及洛汀新组均显示出确切的疗效，但是，益肾方高剂量组的疗效要优于益肾方低剂量组及洛汀新组，提示益肾方对db/db糖尿病小鼠的疗效不亚于洛汀新治疗.益肾方显著降低糖尿病db/db糖尿病小鼠ACR水平，减少肾小球坏死、改善肾小管上皮细胞变性，发挥肾脏保护作用，且对保护性作用在高剂量组(5.0 g·kg-1·d-1)尤为明显，并可使肾小管刷状缘脱落、细胞扁平的比例减少，与之相对应的生化影响为尿蛋白量下降，可能是因为肾小管损伤缓解后，肾小球的灌注压力亦有所减轻，故尿蛋白量下降，从而延缓肾脏失功的进展，展示了中药益肾方在防治DKD损伤方面的重要作用.

综上所述，本研究表明，益肾方治疗db/db糖尿病小鼠疗效显著，可显著改善ACR、胱抑素C水平，减轻肾脏病理变化，并降低其肾脏病理学评分，保护肾脏，且其疗效可能呈剂量依懒性，并独立于血糖水平.

作者贡献声明

邓丽娥：提出研究思路和框架，修改论文；卢汉祺：设计实验、统计分析数据，撰写论文；董晶晶：整理、统计、分析数据;李云逸：整理、统计、分析数据;姚淑焕:整理、统计、分析数据;洪嘉玲:整理、统计、分析数据;林捷:整理、统计、分析数据;范丽静:整理、统计、分析数据;曹锐:设计实验、统计分析数据，撰写论文;董向楠:病理阅片、数据分析、撰写及修改论文;卢永平:整理、统计、分析数据;叶明君:整理、统计、分析数据;BernhardKrämer:提出研究思路和框架;BertholdHocher:提出研究思路和框架;尹良红:提出研究思路和框架，修改论文;李强:提出研究思路和框架，修改论文

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突.