壳寡糖及其溴络合物的抗菌活性研究

冯文娟，马韵升，徐泽平，3 *，刘结磊，孙建忠

（1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东 滨州 256500；2.山东京博控股股份有限公司，山东 滨州 256500；3.滨州市环境微生物技术工程研究中心，山东 滨州 256500）

壳寡糖（oligochitosan）也叫低聚壳聚糖、壳聚寡糖、寡聚氨基葡糖，是壳聚糖经过特殊的生物酶技术[1]、化学降解技术或微波降解技术等降解得到的一种聚合度在2～20之间的低分子质量壳聚糖，分子质量一般≤3 200 u，是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖[2]。它已经作为一种生物保鲜剂[3-5]、饲料添加剂[6]、新型生物农药[7]而被广泛应用。壳寡糖溴络合物是由壳寡糖与单体溴发生络合反应获得的。目前，有不少学者对壳聚糖及其碘络合物的抑菌[8-13]和壳寡糖的抑菌抗菌[14]、抗病毒[15]、抗肿瘤[16]进行了研究，其中，王少南等[17]用氨基寡糖500倍液喷施黄瓜幼苗，抑制黄瓜枯萎病的诱导活性提高59.6%。壳寡糖溴络合物抗菌活性研究少见报道。该研究采用了培养基稀释法和平板计数法，通过微生物在不同浓度壳寡糖及其溴络合物的平板上的生长量，确定壳寡糖及其溴络合物对微生物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），通过MIC和MBC来表征壳寡糖及其溴络合物对大肠杆菌、白色念珠菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性，为新型高效抗菌剂的研制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳寡糖、壳寡糖溴络合物、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：由黄河三角洲京博化工研究院有限公司工业生物研究所提供，其余试剂均为国产分析纯。

LB液体培养基：氯化钠1%、胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%，pH 7.0～7.2。LB固体培养基是在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂粉。用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的培养。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培养基：葡萄糖2%、酵母浸粉1%、蛋白胨2%，pH自然。YPD固体培养基是在液体培养基的基础上添加2%的琼脂粉。用于白色念珠菌的培养。

1.2 仪器与设备

W-CJ-1D型超净工作台：苏州净化设备有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；HZQ-R摇床：常州诺基仪器有限公司；250B生化培养箱：金坛市中大仪器厂；0.22 μm滤膜：上海安谱科学仪器有限公司；FA2004型电子天平、PHS-3C型精密pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-1700型紫外可见分光光度计：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 壳寡糖分子质量的测定

采用乙酰丙酮法测定[18]。

1.3.2 菌种的活化

在无菌条件下，将保藏在试管斜面的受试菌种接种到液体培养基中，在37 ℃，150 r/min转速的摇床上活化24 h，备用。

1.3.3 菌种的培养

在无菌条件下，将活化好的菌种转接到液体培养基中，接种量为5%，在37 ℃，150 r/min转速的摇床上培养24 h，备用。

1.3.4 MIC和MBC的测定

分别配制质量浓度为125 mg/mL的壳寡糖及其溴络合物的溶液，用注射器吸取后过0.22 μm的无菌膜，10 mL无菌小瓶收集备用。在无菌环境下，分别取一定量的壳寡糖及其溴络合物溶液添加到装有50 mL固体培养基的三角瓶中，使壳寡糖及其溴络合物的质量浓度为0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L、6.0 g/L、6.5 g/L、7.0 g/L、7.5 g/L、8.0 g/L、8.5 g/L，充分振荡均匀后，倒3个平板，并做好标记，以不加壳寡糖及其溴络合物的固体培养基作为空白对照培养基。菌液按照10倍梯度稀释法稀释5个梯度，取稀释10万倍的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌悬浊液100 μL均匀混在40～50 ℃的固体培养基平板中；而由于白色念珠菌为好氧菌，待平板中的YPD固体培养凝固后，将白色念珠菌均匀的涂布在培养基上，37 ℃下倒立放置培养，分别在24 h、48 h后计数。空白对照组为未添加壳寡糖及其溴络合物。在空白对照组菌落生长良好的情况下，24 h后无菌落生长的最低药物剂量为最小抑菌浓度（MIC），48 h后无菌落生长的最低药物剂量为最小杀菌浓度（MBC）。

1.3.5 壳寡糖的结构及其分子质量

壳寡糖的化学名称为β-（1,4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，分子式为（C6H11NO4）n（n=2～20），其化学结构如下：

本试验所用的壳寡糖分子质量为2 800 u。

2 结果与分析

2.1 对大肠杆菌的抑制

壳寡糖及其溴络合物对大肠杆菌的抑菌结果如表1所示，壳寡糖对大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为6.5 g/L。壳寡糖溴络合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1.0 g/L，最小杀菌浓度为1.2 g/L。说明了与壳寡糖相比，壳寡糖溴络合物对大肠杆菌的抑菌和杀菌效果更好。

表1 壳寡糖及其溴络合物对大肠杆菌的抑菌效果Table 1 The inhibitory effect of oligochitosan and its bromide complexes on Escherichia coli

2.2 对白色念珠菌的抑制

壳寡糖及其溴络合物对白色念珠菌的抑菌结果如表2所示，壳寡糖对白色念珠菌的最小抑菌浓度为4.0 g/L，最小杀菌浓度为8.0 g/L。壳寡糖溴络合物对白色念珠菌的最小抑菌浓度为1.5 g/L，最小杀菌浓度为2.0 g/L。说明了与壳寡糖相比，壳寡糖溴络合物对白色念珠菌的抑菌和杀菌效果更好。

表2 壳寡糖及其溴络合物对白色念珠菌的抑菌效果Table 2 The inhibitory effect of oligochitosan and its bromide complexes on Candida albicans

2.3 对枯草芽孢杆菌的抑制

壳寡糖及其溴络合物对枯草芽孢杆菌的抑菌结果如表3所示，壳寡糖对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为1.5 g/L。壳寡糖溴络合物对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为1.0 g/L，最小杀菌浓度为1.5 g/L。说明了壳寡糖溴络合物和壳寡糖对枯草芽孢杆菌的杀菌效果相同，而壳寡糖溴络合物的抑菌效果更好。

表3 壳寡糖及其溴络合物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果Table 3 The inhibitory effect of oligochitosan and its bromide complexes on Bacillus subtilis

3 结论

壳寡糖是一种天然、无毒、水溶性好、可生物降解的化合物，已经广泛应用于农业、医药、食品、化妆品等多个领域。普遍认为，壳寡糖的抑菌活性是由于氨基质子化带正电引起的[19]。壳寡糖溴络合物具有良好的水溶性，其抑菌机理未见报道。通过实验结果得出：壳寡糖对大肠杆菌的MIC和MBC均为6.5 g/L；对白色念珠菌的MIC为4.0 g/L，MBC为8.0 g/L；对枯草芽孢杆菌的MIC和MBC均为1.5 g/L。壳寡糖溴络合物对大肠杆菌的MIC为1.0 g/L，MBC 为1.2 g/L；对白色念珠菌的MIC为1.5 g/L，MBC为2.0 g/L；对枯草芽孢杆菌的MIC为1.0 g/L，MBC为1.5 g/L。壳寡糖对大肠杆菌、白色念珠菌和枯草芽孢杆菌具有良好的抑菌活性，壳寡糖溴络合物对其抑菌活性更好，为壳寡糖及其溴络合物在新型绿色生物农药的研发提供了理论基础。本研究下一步将对壳寡糖溴络合物的制备工艺及结构鉴定、抑制真菌、抑菌机理进行研究，为其工业化生产和应用提供参考。

[1]虞凤慧，徐泽平，谢海涛.一株产壳聚糖酶芽孢杆菌的分离及鉴定[J].中国酿造，2015，34（1）：65-67.

[2]黄惠莉，朱利平.壳聚糖酶的研究进展[J].食品工业科技，2012，33（6）：439-443.

[3]聂青玉，刘 丹，王燕飞，等.壳寡糖处理对草莓贮藏品质的影响[J].农产品加工，2010，215（7）：31-33.

[4]邓丽莉，黄 艳，周玉翔，等.壳寡糖处理对柑桔果实贮藏品质的影响[J].食品工业科技，2009，30（7）：287-290.

[5]聂青玉，侯大军.壳寡糖处理对红橘果实贮藏品质和生理的影响[J].西南大学学报：自然科学版，2010，32（10）：37-41.

[6]高 巍，陈 帅，丁兆坤，等.饲料中添加壳寡糖对动物机体的影响[J].动物营养学报，2014，26（2）：322-326.

[7]许 珍.壳寡糖新型生物农药的研制及应用研究[D].武汉：华中农业大学硕士论文，2012.

[8]冯小强，李小芳，杨 声.壳聚糖抑菌性能影响因素、机理及其应用研究进展[J].中国酿造，2009，27（1）：19-23.

[9]冯小强，杨 声，王延璞，等.不同分子量壳聚糖对大肠杆菌抑制作用规律及其机理探讨[J].中国酿造，2007，26（2）：16-19.

[10]DEVLIEGHERE F,VERMEULEN A,DEBEVERE J.Chitosan:antimicrobial activity,interactions with food components and applicability as a coating on fruit and vegetables[J].Food Microbiol,2004,21(6):703-714.

[11]SEKIGUCHI S,MIURA Y,KANEKO H,et al.Molecular weight dependency of antimicrobial activity by chitosan oligomers[J].Food Hydrocoll,1994,2:71-76.

[12]张启锋，伍 甜，秦 涛，等.壳聚糖碘液抗白色念珠菌活性的研究[J].衡阳师范学院学报，2010，31（6）：64-66.

[13]何淑雅，王芳宇，李邦良，等.壳聚糖碘液的制备及抗真菌活性研究[J].南华大学学报：医学版，2001，29（3）：227-229.

[14]闫海侠，刘 佳，孟祥红.壳寡糖对大肠杆菌抑菌作用的研究[J].农产品加工·学刊，2014，10（4）：1-4.

[15]马 镝，赵秀香，吴元华.壳寡糖对烟草花叶病毒的抑制作用及其对烟草酶活性的影响[J].中国生物防治，2008，24（2）：154-158.

[16]曹秀明，徐海娇，尚 明，等.壳寡糖抗肿瘤和免疫调节作用的实验研究[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2006，22（4）：8-10.

[17]王少南，喻大昭.壳聚糖（低聚糖）诱导功能的发现及在植物保护上的开发利用[J].湖北农业科学，2002，48（5）：93-94.

[18]徐泽平，杨传伦，张心青，等.乙酰丙酮法测定壳寡糖的含量[J].现代科学仪器，2012，29（3）：64-67.

[19]KITTUR F S,VISHU KUMAR A B,VARADARAJ M C,et al.Chitooligosaccharides-preparation with the aid of pectinase isozyme fromAspergillus nigerand their antibacterial activity[J].Carbohyd Res,2005,340(6):1239-1245.