食用菌发酵液对耐药菌的抑菌活性研究

窦会娟，孙连海，郭文涛

（漯河医学高等专科学校 基础医学部，河南 漯河 462002）

早在19 世纪70 年代，人们就发现多种担子菌子实体、食用菌深层发酵液和固体培养物水浸液对植物病毒有抑制作用[1-2]。后又有多人研究结果表明，食用菌多糖具有抑菌作用[3-6]，本研究组也有研究表明，香菇的液体发酵产物对机体致病菌也有一定的抑菌作用[7]。近几年，由于抗生素的广泛使用，临床上出现的耐药菌日渐增多，给治疗带来麻烦。我国药食用真菌资源丰富，无毒副作用，而且大型药食用真菌可以较方便地通过菌丝体或孢子发酵培养[8]，但其发酵液对耐药菌的抑菌情况的研究较少。

本研究选用香菇（Lentinula edodes）、鸡腿菇（Coprinus comaus）、金针菇（Flammulina velutipes）、茶树菇（Agrocybe aegerita）、杏鲍菇（Pleurotus eryngi）、木耳（Auricularia auricula）、猴头菇（Hericium erinaceus）7种较常见的食用菌菌种，采用液体深层发酵的方法获得其发酵液，以儿科临床分离得到的3种耐药菌较强的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）为指示菌，用管碟法测定发酵液对细菌的抑菌圈，通过抑菌率反映其对耐药菌的抑菌效果，为更好地开发食用菌相关产品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 食用菌与指示菌

供试食用菌分别是香菇、鸡腿菇、金针菇、茶树菇、杏鲍菇、木耳、猴头菇：本实验室保存菌种；供试耐药菌分别为肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）：漯河市某医院儿科临床分离标本并保存；肺炎链球菌ATCC 49619、金黄色葡萄球菌ATCC 2592、大肠埃希菌ATCC25922标准菌株：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[9]：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.5g，硫酸镁MgSO4·7H2O0.25g，琼脂20g，加水至1 000 mL。

一级摇瓶液体培养基[10]：蔗糖30 g，蛋白胨3 g，酵母2 g，硫酸胺2 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，加水至1 000 mL，调pH值至7.0。

液体发酵培养基：蔗糖30 g，玉米粉20 g，麸皮40 g，加水至1 000 mL，调pH值至7.0。

1.1.3 化学试剂

磷酸二氢钾（KH2PO4）：天津市风船化学试剂科技有限公司；硫酸铵：郑州辰尼化学试剂厂；七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、葡萄糖：天津市科密欧科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHZ-CA 大容量恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂；LRH-250-HS恒温恒湿培养箱：广东省医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 食用菌菌种的活化

取出保存菌种，用接种环取出一小块，在含有玻璃珠的无菌水中振荡，用无菌吸管吸取0.2 mL涂平板，28 ℃培养6 d，挑取单菌落移接到斜面PDA培养基上，加上棉塞，置恒温培养箱内，28 ℃培养6 d后可见组织块上长出绒毛状菌丝，菌丝长满斜面即得斜面菌种。

1.3.2 液体种子制备

用300 mL三角瓶装液体种子培养基100 mL，接入活化的斜面菌种（0.4 cm2大小5块）。放入28 ℃、180 r/min下的摇床培养5 d，即得液体摇瓶种子。

1.3.3 发酵培养

参照香菇液体发酵产抑菌物质活性最高的发酵条件[11]，发酵液初始pH 值为5，300 mL三角瓶装液体发酵培养100 mL，接入7%的液体菌种，于28 ℃、180 r/min的摇床中培养8 d。

1.3.4 细菌菌悬液制备

将细菌菌株接种于PDA斜面，37 ℃培养48 h，用生理盐水配成106～107CFU/mL的菌悬液备用。

1.3.5 管碟法[12]测定抑菌活性

采用密集划线法将细菌接种于PDA平板培养基上，在培养皿中间放置1个灭菌牛津杯（高10 mm、内径6 mm），每个牛津杯中加入200 μL液体发酵液，置30 ℃恒温培养箱中进行培养，48 h后测量抑菌圈直径，细菌的标准菌株和相应的临床分离菌株同时进行，每个处理重复3次，计算菌落直径和相对抑菌率[13]。

2 结果与分析

2.1 食用菌发酵液对肺炎链球菌的抑制

采用管碟法测定食用菌发酵液对肺炎链球菌标准菌株和临床分离菌株的抑菌圈，并计算相对抑菌率，结果见表1。

表1 食用菌发酵液对肺炎链球菌的抑菌情况Table 1 The inhibition effect of mushroom fermentation broth to Streptococcus pneumoniae

由表1可知，各食用菌发酵液对肺炎链球菌的抑菌活性是较低的，鸡腿菇发酵液的抑菌圈直径4.433 mm为最大值，杏鲍菇发酵液的抑菌圈直径1.033 mm，为最小值。且各食用菌发酵液对分离到的肺炎链球菌的相对抑菌率也都较低，鸡腿菇发酵液的相对抑菌率30.370%为最大值，金针菇和杏鲍菇发酵液的相对抑菌率最低，均在10%以下。结果表明，食用菌发酵液对肺炎链球菌的抑菌效果较差。

2.2 食用菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制

采用管碟法测定食用菌对金黄色葡萄球菌标准菌株和临床分离菌株的抑菌圈，并计算相对抑菌率，结果见表2。

表2 食用菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌情况Table 2 The inhibition effect of mushroom fermentation broth to Staphyloccocus aureus

由表2可知，金针菇发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大，达到6.733 mm，香菇发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径次之，为5.068 mm。香菇的相对抑菌率最高，为62.017%；金针菇次之，58.686%。相对于肺炎链球菌及大肠杆菌来说，7种食用菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径和相对抑菌率均较高，有较好的抑菌活性。

2.3 食用菌发酵液对大肠杆菌的抑制

采用管碟法测定食用菌对金黄色葡萄球菌标准菌株和临床分离菌株的抑菌圈，并计算相对抑菌率，结果见表3。

表3 食用菌液体发酵液对大肠杆菌的抑菌情况Table 3 The inhibition effect of mushroom submerged fermentation broth to Escherichia coli

由表3可知，金针菇发酵液对大肠杆菌的抑菌圈直径最高，达到了5.267 mm，但其相对抑菌率很低（＜10%）；其他食用菌发酵液对大肠杆菌的相对抑菌率均＜30%。结果表明，食用菌发酵液对肺炎链球菌的抑菌效果较差。

3 结论

从实验结果来看，同一种食用菌对不同病原菌的抑菌作用差别较大，可能是不同细菌的致病机制不同而引起的，也可能是由于不同细菌的耐药机制不同而引起的。

本实验中的相对抑菌率实质上体现的是食用菌发酵液对标准菌株和临床分离菌株的抑菌情况的比率，相对抑菌率高就代表该食用菌对耐药菌的抑菌效果好。李孙洋等[14]研究结果表明，相对抑菌率在50%以上有开发利用价值。本实验选用的临床分离菌株金黄色葡萄球菌中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）检出率为53.8%，而且该菌株对青霉素、头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、四环素、阿奇霉素、克林霉素的耐药性均较高，MRSA的耐药率明显高于对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（methicillin susceptibleStaphylococcus aureus，MSSA）[15]，所以对于临床分离到的耐药性较强的金黄色葡萄球菌，下一步可以考虑开发食用菌的液体发酵产物来控制其感染。但对于大肠杆菌和肺炎链球菌来说，由于各食用菌发酵液对其抑菌圈和相对抑菌都较低，想要考虑利用食用菌发酵产物来进行抑菌意义就不大了。

本研究所选用的食用菌品种均比较常见，其液体发酵方法也比较成熟，但其对临床耐药菌的抑菌研究还鲜有报道。由于发酵液只进行了初步纯化，下一步有必要对发酵液的活性物质和发酵条件进行进一步深入研究。

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