传统发酵豆酱中产蛋白酶菌株的筛选

孙晓东，吕国忠 *，栾雨时，陈 嵘，赵志慧

（1.大连理工大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024；2.大连民族大学环境与资源学院，辽宁 大连 116600；3.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116600）

豆酱也称黄豆酱或大豆酱，在我国北方地区俗称大酱，是中国传统的发酵食品，距今已有超过3 000年的历史[1]。发酵豆酱保留了大豆本身的营养成分，增加了蛋白质的含量，消除了胰蛋白酶抑制剂，并将大豆蛋白进一步分解成人体所能直接吸收利用的小肽[2]，使得豆酱成为营养丰富、口味独特、易于消化吸收的调味品。由于传统的家庭自制豆酱是自然发酵而成，在完全开放式的制作过程中，空气中的大量微生物自由落入，形成特殊的微生物区系，其中真菌伴随在豆酱的整个制作过程，米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）等有益菌分解大豆蛋白，形成豆酱特有的风味和营养[3]。

微生物蛋白酶是一类由微生物分泌到胞外用于降解一些难以利用的营养物质的蛋白水解酶，目前应用于干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性等方面。在其的作用下，人体内摄入的蛋白被水解成小分子肽和氨基酸[4]，如曲霉和毛霉是发酵食品生产中应用最为广泛的发酵菌种[5]。本研究对254份采自东三省各地的家庭自制豆酱进行分离，获得纯培养真菌菌株389株，并用形态学分类将其鉴定到种[6-12]，明确了各菌株的分类地位。对这些菌株进行了蛋白酶活性的筛选，通过平板透明圈法[13]、发酵复筛等获得高产蛋白酶的菌株，并对其蛋白酶活性进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1%牛奶琼脂培养基：10 g脱脂牛奶，20 g琼脂，加水定容至1 000 mL，pH值自然；复筛培养基：煮熟大豆20 g，pH值自然；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

自然发酵豆酱：东三省各地的农户家；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、福林酚试剂（分析纯）：上海索莱宝生物科技有限公司；酪氨酸：上海酶联生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

奥林帕斯CX21显微镜：日本奥林帕斯株式会社；Sigma2-16KL离心机：德国Sigma公司；HZQ-Q全温振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；SW-CJ-ID型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；FA2004型电子天平：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

用接种针将保存于冻存管里的各供试菌株接入新鲜的PDA平板中，25 ℃黑暗培养，待长出菌落后进行菌株的初筛。

1.3.2 产蛋白酶菌株的初筛

采用平板透明圈法进行菌株初筛。在直径9 cm的无菌培养皿中，注入15 mL脱脂牛奶培养基，待凝固成平板后，挑取单菌落接种于平板上，置25 ℃黑暗培养。记录透明圈半径，选取形成透明圈的菌株进行复筛的发酵培养。

1.3.3 发酵复筛

取煮熟的大豆20 g，置于150 mL三角瓶中，灭菌。将新鲜菌株制成浓度为1×106CFU/mL的菌悬液，取1 mL置于灭菌的大豆中，于25 ℃黑暗培养15 d。

1.3.4 酶液的制备

将发酵15 d的大豆三角瓶从培养箱中取出，加入50 mL无菌的去离子水，分散均匀，30 ℃振荡培养4 h，静置。滤液4 200 r/min离心20 min，取上清液作为粗酶液测定。

1.3.5 标准曲线的制作

采用福林酚法测定蛋白酶的活性。首先配制不同质量浓度的酪氨酸标准液，如表1所示。分别取不同质量浓度酪氨酸1 mL，各加入0.4 mol/L碳酸钠5 mL，Folin试剂工作液1 mL，摇匀置于水浴锅中，40 ℃保温发色20 min，用分光光度计在波长680 nm处测定吸光度值[14]。以吸光度值（y）为纵坐标，酪氨酸质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。

表1 不同质量浓度酪氨酸溶液的配制Table 1 Preparation of different concentration of tyrosine

1.3.6 蛋白酶活性测定

酶活定义：在一定pH值和40 ℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量定义为一个蛋白酶活力单位，U。每个样品做3个平行试验，取平均值计算酶活力。计算公式如下：

式中：U为样品的酶活力，μg/mL；C为由标准曲线得到的酪氨酸溶液的质量浓度，μg/mL；N为酶液的稀释倍数；4为反应试剂总体积，mL；10为反应时间，min；V为酶液的总体积，mL。

反应过程如下[14]：

从反应过程可以看出，样品和空白管中，酪蛋白和三氯乙酸（TCA）的加入顺序不同，前者酪蛋白与待测酶液充分反应，而后者先加入的TCA阻止了酶液和酪蛋白的反应。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

绘制酪氨酸标准曲线如图1所示，并得回归方程：y=0.009 5x+0.000 8，其中y为吸光度值（OD680nm），x为酪氨酸质量浓度。相关系数R2=0.996 9，表明二者线性关系良好。

图1 酪氨酸的标准曲线Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 产蛋白酶菌株的筛选结果

将分离自豆酱的389株真菌进行脱脂牛奶平板透明圈法初筛，其中共有31株表现出蛋白酶活性，在培养基的背面形成了透明的水解圈。用福林酚法测定发酵复筛后的粗酶液，各菌株都表现出了不同程度的蛋白酶活性。各菌株的透明圈大小及酶活详见表2。

表2 各菌株的透明圈大小及酶活力Table 2 The transparent zone diameter and protease activity of the stains

由表2可以看出，从豆酱上分离到的多种真菌都具有合成蛋白酶的能力，编号为JMHKA和JYSA的菌株蛋白酶活性远远高于其他菌株，这两株菌是分别采自吉林梅河口和吉林榆树的米曲霉。米曲霉是公认的食品安全菌株，具有很强的蛋白酶合成能力，其蛋白酶在较广的pH 范围内均具有活性，另外由于米曲霉含有丰富的糖苷水解酶，可以利用淀粉或纤维素等廉价原料高效生产蛋白酶，所以米曲霉是食品用蛋白酶的主要来源菌株[15]。这两株高酶活的米曲霉可以用于后续的蛋白酶的分离纯化，及酶学性质的研究。

表2中还有4株真菌在脱脂牛奶平板上产生了透明圈，表现出了蛋白酶活性，可在后续的发酵培养中，粗酶液的酶活为负值。这种现象出现的原因，可能为福林酚法测酶活时，酶液与酪蛋白作用出现了问题，或者发酵培养的条件不适合菌株的生长，使菌株出现了生长停滞或者代谢迟缓等问题。

3 结论

试验测得的透明圈大小与粗酶液的酶活力并不完全成正相关，究其原因，可能为脱脂牛奶平板的营养状况和培养条件并不是某些菌株适宜的生长条件，因此出现了透明圈半径小，而发酵液酶活大的情况。由此可以得出，如果仅仅依靠初筛的透明圈半径来筛选强酶活的菌株是不精准的，建议对产生透明圈的菌株都应该进行复筛发酵。

用脱脂牛奶平板对分离到的389株真菌进行蛋白酶活性的初筛，得到了31株产生透明水解圈的菌株，其中曲霉属的真菌12株、青霉5株、毛霉4株、镰孢菌3株、帚霉1株、芽枝孢3株、犁头霉1株、红曲2株。曲霉属的真菌无论从数量还是酶活都远远高于其他属的真菌，是豆酱发酵过程中分解大豆蛋白的主要功能菌株。其他属的真菌也具有或高或低的蛋白酶合成能力，在豆酱的发酵中应该是多菌株混合发酵，相互协同，共同将大豆蛋白降解。

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