多菌混合发酵鲜枣果醋的工艺研究

杨建红，张惠玲*，张卫峰

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

2012年4月国家出台了果醋饮料标准，这意味着纯发酵型高品质果醋将会替代勾兑型果醋。发酵型红枣果醋的开发，不但解决了一些次果、落果的再加工问题，提高了附加值，而且为红枣深加工方面开辟了一条新的道路。本试验采用鲜枣为原料进行果醋发酵，由于传统式果醋的发酵过程是用酵母发酵后再经过醋酸菌发酵制得果醋，口感有些尖酸，香气淡薄，为了提高枣醋的品质与口感上的柔和度，试验采用酵母菌和乳酸菌进行混合发酵完成酒精发酵阶段，增加乳酸等其他代谢物，赋予果醋特殊的风味。试验中采用的乳酸菌是从自然发酵的鲜枣汁中分离得到的一株乳酸菌，通过试验以获得最佳混菌发酵枣醋工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁夏灵武鲜枣：宁夏灵武果业有限公司。葡萄酒活性干酵母：法国XR公司；植物乳酸菌：宁夏大学生物工程实验室分离选育；醋酸菌AS.1.41：宁夏灵武果业有限公司。果胶酶：诺维信公司；柠檬酸、抗坏血酸：广州市利士诺丹生物科技有限公司。

MRS培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢钠2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温-80 1.0 g，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.6。

麦芽汁液体培养基：优质麦芽经过粉碎、糊化、糖化、过滤得到麦芽汁培养基。

基础培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 仪器与设备

HW-250生化培养箱：哈尔滨东明医疗仪器厂；PHS-3B型精密pH 计：上海雷诺仪器厂；SP7BOO型气相色谱仪：北京谱莱析科技有限公司；WZ1110/ATC型手持糖度仪：北京阳光亿事达贸易有限公司；JS31-300型水果榨汁机：苏泊尔公司；HI98168型溶氧测定仪：上海铂勒机电设备有限公司；AME10升玻璃小型发酵罐：南京润泽生物工程设备有限公司；酒精比重计：银川伟博鑫生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

成熟灵武鲜枣→筛选→清洗→去核→用含60 mg/L SO2水清洗杀菌→捞出→加无菌水打浆（料水比为1∶3）→酶解、澄清过滤→护色、调整成分→鲜枣汁→接种（酵母菌、乳酸菌）→酒精发酵→发酵结束→接种醋酸菌→醋酸发酵→过滤→巴氏灭菌→枣醋

1.3.2 酒精发酵试验

乳酸菌接种量的确定：乳酸菌与酵母菌生长条件相似，并且二者的代谢产物对彼此的生长代谢具有互相制约、互相促进的作用[2-3]，所以在发酵过程中只有控制合适的接种比例才能更好地发挥其作用，进而使枣醋的香味物质更加丰富[4-5]。在酵母菌接种量2.0%，发酵温度28 ℃，初始糖度15%，初始pH 4.5的条件下，调整乳酸菌的接种量分别为0.4%、1.0%、1.6%、2.0%、3.0%，发酵结束后测定酒精度和乳酸含量。

发酵pH值确定：本试验选用的乳酸菌的适宜pH为4.5～6.5，酵母菌的适宜pH值范围为3.0～4.5，在混菌发酵过程中综合考虑两种菌的适宜pH值[6]，设置pH梯度为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5。发酵过程中酵母菌接种量为2.0%，乳酸菌接种量为1.6%，初始糖度为15%，发酵温度为28 ℃，发酵结束后测定发酵液中酒精度和乳酸含量。

发酵温度的确定：在酵母菌接种量为2.0%，乳酸菌接种量为1.6%，酵母菌与乳酸菌的接种比为1∶0.8，发酵液初始pH值为4.5，最初糖度为15%条件下，调整发酵温度分别为24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，发酵结束后测定发酵液中的酒精度和乳酸含量。

初始糖度的确定：在酵母菌接种量为2.0%，乳酸菌接种量为1.6%，初始pH为4.5，发酵温度为28 ℃的条件下，调整初始糖度分别为11%、13%、15%、17%、19%，发酵结束后测定发酵液中的酒精度和乳酸含量。

正交试验：在单因素的试验基础上，选择发酵温度（A）、发酵pH值（B）、初始糖度（C）、乳酸菌接种量（D）4个因素，以发酵液的酒精度为评介指标进行L9（34）正交试验确定最佳发酵条件[7-8]，正交试验因素与水平见表1。

表1 酒精发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for alcohol fermentation conditions optimization

1.3.3 醋酸发酵试验

发酵温度的选择：在搅拌转速为200 r/min、接种量为10%的条件下，调整发酵温度分别为24℃、26℃、28℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃，发酵结束后测定发酵液酸度。

接种量的选择：在发酵温度为32 ℃、搅拌转速为200 r/min的条件下，调整接种量分别为4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，发酵结束后测定发酵液的酸度[9-10]。

搅拌转速的选择：醋酸菌是好氧微生物，采用磁力搅拌进行供氧，并控制装液量为40%，使醋酸菌充分利用氧气。在发酵温度为32 ℃、接种量为10%的条件下，调整搅拌转速分别为160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min，发酵结束后测定发酵液的最终酸度。

正交试验：在单因素试验的基础上设计正交试验，选择发酵温度A（℃）、搅拌转速B（r/min）、接种量C（%）3个因素，以发酵结束后发酵液的总酸含量为评介指标进行L9（33）正交试验确定醋酸发酵的最佳条件[10-11]，正交试验因素水平见表2。

表2 醋酸发酵条件优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic fermentation conditions optimization

1.3.4 测定方法

乳酸含量测定：内标气相色谱法；还原糖测定：斐林试剂法；酒精度的测定：酒精比重计法；总酸测定：酸碱中和法[1]。

2 结果与分析

2.1 混菌酒精发酵单因素试验

2.1.1 乳酸菌接种量对酒精发酵的影响

图1 乳酸菌接种量对酒精发酵的影响Fig.1 Effect of lactic acid bacteria inoculum on fermentation

由图1可知，乳酸菌接种量为1.6%～2.0%时，酵母菌与乳酸菌的协同发酵性能好[8]，酒精度达到7.5%vol左右，乳酸含量为2.42～2.45 g/L。乳酸菌接种量为0.4%及1.0%时虽然酒精度稍高，但乳酸含量较低，所以选择乳酸菌接种量1.6%为宜。

2.1.2 pH值对酒精发酵的影响

图2 pH值对酒精发酵的影响Fig.2 Effect of pH on fermentation

由图2可知，当pH值为4.5时，发酵液中酒精度为8.67%vol，乳酸含量达到2.4 g/L。pH 4.0时虽然酒精度稍高于pH4.5，但乳酸含量较低，所以选择pH 4.5为宜。

2.1.3 温度对酒精发酵的影响

图3 温度对酒精发酵的影响Fig.3 Effect of temperature on fermentation

由图3可知，温度为28℃时，发酵液中酒精度为8.75%vol，乳酸含量为2.38 g/L。所以选择温度28 ℃为最适宜条件。

2.1.4 初始糖度对酒精发酵的影响

图4 初始糖度对酒精发酵的影响Fig.4 Effect of initial sugar content on fermentation

由图4可知，初始糖度为17%时酒精度为9.6%vol，乳酸含量为2.04 g/L。酒精度过高或过低会影响醋酸菌的发酵[12-14]。所以选择初始糖度17%为宜。

2.2 混菌酒精发酵正交试验

在单因素试验基础上进行正交试验，以确定酒精发酵的最佳条件，正交试验结果与分析见表3。

表3 鲜枣果醋酒精发酵正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fresh date vinegar alcohol fermentation conditions optimization

由表3可知，正交试验最优组合为A2B2C3D1，即温度28℃，pH 4.5，乳酸菌接种量2.0%，初始糖度15%时酒精度最高，为8.4%vol。4个因素对酒精度影响的大小为A＞C＞B＞D，即发酵温度＞乳酸菌接种量＞pH值＞初始糖度。发酵结束后，枣汁醪液中乳酸含量为2.13 g/L，在该含量乳酸存在的条件下，不影响醋酸菌的醋酸发酵，但会使醋酸发酵结束后酸味变的柔和，香气更好。

2.3 醋酸发酵试验

2.3.1 温度对醋酸发酵的影响

图5 温度对醋酸发酵的影响Fig.5 Effect of temperature on acetic acid fermentation

由图5可知，当温度在32 ℃时产酸最高，所以选择温度为30 ℃、32 ℃、34 ℃进行正交试验。

2.3.2 接种量对醋酸发酵的影响

图6 接种量对醋酸发酵的影响Fig.6 Effect of inoculum on acetic acid fermentation

由图6可知，接种量为12%时，发酵液中总酸含量最高，所以选择接种量10%、12%、14%进行正交试验。

2.3.3 搅拌转速对醋酸发酵的影响

图7 搅拌转速对醋酸发酵的影响Fig.7 Effect of stirring speed on acetic acid fermentation

由图7可知，搅拌转速为200 r/min时，发酵液中总酸含量最高，所以选择搅拌转速180 r/min、200 r/min、220 r/min进行正交试验。

2.4 醋酸发酵正交试验

在单因素试验基础上进行正交试验，以确定醋酸发酵的最佳条件，正交试验结果与分析见表3。

由表3可知，A3B2C2为最优组合，即在发酵温度为34 ℃；搅拌速率200 r/min；接种量为12%时，产酸量最高，总酸含量达到5.7 g/100 mL。3个因素对总酸含量的影响大小为B＞A＞C，即搅拌速率＞发酵温度＞醋酸菌接种量。

2.5 产品指标

感官指标：淡黄色、均匀透亮，无沉淀，有突出的枣香，口感丰富、香气浓郁、酸度柔和。

理化指标：可溶性固形物（20 ℃折光计法）4.5%；总酸（以醋酸计）5.7 g/100 mL；挥发酸（以苹果酸、柠檬酸、酒石酸计）0.35 g/100 mL。

表3 鲜枣果醋醋酸发酵正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fresh date vinegar acetic fermentation conditions optimization

微生物指标：菌落总数≤60 CFU/mL；大肠菌群、致病菌、霉菌未检出。

3 结论

本研究采用乳酸菌、酵母菌、醋酸菌多菌种发酵制得鲜枣醋，利用乳酸菌和酵母菌之间的相互作用以共同影响枣醋品质的特点，增加香气和枣醋的柔和度，提高枣醋品质。试验对酒精发酵过程中乳酸菌与酵母菌的协同发酵条件以及醋酸发酵过程的工艺条件进行了研究，确定了酒精厌氧发酵阶段和醋酸有氧发酵阶段的最佳工艺条件。试验结果表明，酵母菌接种量为2.0%，乳酸菌的接种量为2.0%，发酵pH值为4.5，发酵温度为28 ℃，初始糖度为15%。醋酸菌发酵接种量为12%，发酵温度为34 ℃，搅拌转速200 r/min。在此条件下乳酸菌、酵母菌协同作用较好，产生一定量乳酸和其他代谢产物，使枣醋更加柔和，减少了尖酸感；同时乳酸与酵母菌产生的乙醇可以发生酯化反应，增加了枣醋的醇厚感，增加了风味物质，提高了鲜枣果醋的品质。

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