固相微萃取结合气-质分析东北大酱的挥发性成分

孙洁雯，李燕敏，刘玉平*

（北京工商大学，北京市食品风味化学重点实验室，食品质量与安全北京实验室，食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，北京 100048）

东北特产大酱是以黑龙江特级大豆为主要原材料，经过选料、烀豆、搅碎、做酱块、晒酱块、下酱、倒酱等加工工序，最后制得的半固体状调味食品[1]。在加工过程中由于酶的作用，促使豆中更多的磷、钙、铁等矿物质被释放出来，提高了人体对大豆中矿物质的吸收率；此外，加工过程中由于微生物作用可合成核黄素等，因此，大酱营养比大豆更易于消化吸收[2]。另外，大酱中含有的脂肪成分大部分为不饱和脂肪酸，故胆固醇含量很低，具有提高血液循环的作用[3]。

近年来对于酱类调味品的研究主要集中于工艺的改进和微生物的检测，如冯治平等[4]采用酶促法对甜面酱的生产工艺条件进行了研究分析，徐鑫等[5]采用16S rDNA的方法对大酱中耐盐性乳酸菌进行了鉴定。关于酱中的挥发性成分报道较多[6-7]，而关于东北特产大酱中的挥发性成分鲜见报道。固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）技术具有操作便捷、样品用量少的特点，被广泛应用于各种食品挥发性成分的检测[8]。

本研究采用固相微萃取法结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用分离鉴定东北特产大酱的挥发性成分，分析比较提取时间和提取温度对挥发性成分提取效果的影响，旨在较准确地鉴定出东北特产大酱的挥发性成分，对大酱的风味及形成机理进行研究，为大酱的风味评价及工艺改进提供更好的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大酱：黑龙江省双城市某食品有限责任公司，生产日期为2015年6月12日；C5～C30正构烷烃混合物（色谱纯）：美国Supelco公司；正己烷（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司；固相微萃取专用采样台、手动进样手柄及DVB/CAR/PDMS萃取头（50/30 μm，灰色）、7890B气相色谱-5977A型质谱联用仪：美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

先将固相微萃取纤维头在气相色谱进样口于250 ℃老化至无杂峰，取4 g样品放入15 mL的样品瓶中，放入60 ℃恒水浴锅里，平衡10 min后，再将纤维头插入瓶中，顶空吸附40 min后拔出，在温度250 ℃的GC-MS仪的气相色谱进样口中解析5 min，进行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS条件

气相色谱（GC）条件：HP-5MS型色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，然后以5℃/min的速度升到200℃，再以15℃/min的速度升到280 ℃，保持2 min；进样口温度250 ℃，不分流，载气为He，载气流速为1.0 mL/min。

质谱（MS）检测条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆150 ℃，传输线温度230 ℃，全扫描模式，扫描质量范围为25～500 amu，无溶剂延迟。

1.3.3 挥发性化合物鉴定

定性方法：以美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）谱库检索为主，同时结合人工解析质谱图；计算挥发性成分的保留指数，并与文献值进行比对。选择匹配度＞75%的化合物。保留指数（retention index，RI）计算公式如下[9]：

式中：RI为保留指数；ti为待测组分的调整保留时间，min；tn为具有n个碳原子的正构烷烃的调整保留时间，min；tn+1为具有n+1个碳原子的正构烷烃的保留时间，min。

定量方法：采用面积归一化法，求得各挥发性成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 提取时间对挥发性成分提取效果的影响

选取提取时间为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，考察提取时间对提取效果的影响，结果见图1。

由图1可知，随着提取时间的增加，总峰面积和分离出的有效峰个数均逐渐增大；提取时间达到40 min时，总峰面积和分离出的有效峰个数均达到较大值，这是由于提取的挥发性成分大多是易挥发、低沸点的成分，提取时间较短时，吸附提取不完全；随着提取时间的增长，吸附提取逐渐充分完全。提取时间继续增加，分离出的有效峰个数和总峰面积均逐渐减小，这是由于提取时间过长时，一方面会使得易挥发、低沸点成分的解析增加，另一方面水及一些挥发性低的成分被萃取出来，使得有效成分数减少；故提取时间为40 min时较为适宜。

图1 提取时间对东北特产大酱挥发性成分提取效果的影响Fig.1 Effect of extraction time on the extraction of volatile compounds from northeast soybean paste

2.2 提取温度对挥发性成分提取效果的影响

提取时间为40 min，分别选取提取温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，考察提取温度对大酱中挥发性成分提取效果的影响，结果见图2。

图2 提取温度对东北特产大酱挥发性成分提取效果的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction of volatile compounds from northeast soybean paste

由图2可知，提取温度逐渐升高，总峰面积和分离出的有效峰个数均逐渐增大；温度达到60 ℃时，总峰面积和分离出的有效峰个数均达到较大值；温度继续升高，分离出的有效峰个数和总峰面积均有所减小。这是由于提取温度较低时，大酱所含成分没有完全挥发出来，而温度过高时会使得易挥发、低沸点成分的解析增加；故提取温度为60 ℃时较为适宜。

2.3 挥发性成分分析

采用固相微萃取法对东北特产大酱中的挥发性成分萃取40 min，水浴温度60 ℃，结合GC-MS对得到的挥发性成分提取物进行分析，所得总离子流色谱图如图3所示，鉴定出的成分见表1。

图3 东北特产大酱中挥发性成分总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of volatile compounds from northeast soybean paste

表1 东北特产大酱中挥发性成分的GC-MS分析结果Table 1 GC-MS analysis results of volatile constituents in northeast soybean paste

续表

由图3和表1可以看出，采用较优的提取条件来提取东北特产大酱的挥发性成分，并且经GC-MS分析，共鉴定出28种挥发性成分，相对含量占总流出物的89.02%，包括酮类3种（53.57%）、酸类3种（13.36%）、醇类2种（13.20%）、酯类8种（3.57%）、酚类2种（2.44%）、醛类5种（1.55%）、其他类5种（1.33%）。其中相对含量＞1%的成分有：3-乙酰基-6-甲基-2,4-吡喃二酮（53.38%）、乙醇（12.93%）、苯甲酸（7.78%）、乙酸（5.26%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（1.93%）、苯甲酸乙酯（1.48%）。

鉴定出来的挥发性成分种类中酯类化合物种类较多，其中苯甲酸甲酯具有浓郁的冬青油和卡南迦油香气；苯甲酸乙酯具有类似依兰的香气并微带果香；棕榈酸甲酯和棕榈酸乙酯呈微弱蜡香、果香和奶油香气[23]；而油酸甲酯、油酸乙酯、亚油酸甲酯和亚油酸乙酯可能是由大豆中所含的油酸及亚油酸衍生而来，呈油脂香气。这些酯类化合物赋予了东北特产大酱果香、甜香和脂香。

其次是醛类化合物，醛类化合物的阈值较低，对大酱整体香气贡献较大。醛类化合物的形成可能是发酵过程中放热引起不饱和脂肪酸脱羧基或碳链氧化[24]。苯甲醛具有近似苦杏仁的气味；苯乙醛有近似风信子花香和甜香；（反）-2-辛烯醛呈清新的瓜香、草香及香蕉叶样脂肪气息；壬醛和（反）-2-壬烯醛具有青香及瓜果香[23]。这些醛类化合物赋予了大酱坚果香、青香和瓜果香。

酮类和醇类化合物虽种类较少，但其相对含量均较高，分别为53.57%和13.20%，其中挥发性成分3-乙酰基-6-甲基-2,4-吡喃二酮相对含量为53.38%，具有焦甜气息[25]；3-辛酮具有水果微带薰衣草的气味[25]；醇类化合物中，1-已烯-3-醇具有蘑菇香气和草香[25]。酮类和醇类化合物赋予了大酱果香、草香。

酚类化合物中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚呈强烈香辛料、丁香和发酵似香气，有炒花生气息[25]；愈创木酚具有烟熏、辛香、药香、肉香香气[25]。酸类化合物中，乙酸可能部分是由生产过程中乙醇氧化而成或微生物发酵而成。而其他类化合物中，2,3,5,6-四甲基吡嗪具有坚果香、可可和咖啡的香气特点[23]。这些化合物赋予了东北特产大酱辛香、酱香、烤香，使大酱整体香气透发。

从鉴定出来的物质用途来看，有的酚类、酮类、及酯类挥发性成分具有防腐抗菌、抗氧化等功效。酚类化合物中，愈创木酚及相应的衍生物具有一定的抑菌作用；酮类化合物中，3-乙酰基-6-甲基-2,4-吡喃二酮，又名脱氢乙酸，它及其钠盐均为常用防腐剂，对霉菌有较强的抑制作用；酯类化合物中的亚油酸甲酯对急慢性炎症有一定的防治作用，而亚油酸乙酯具有降低胆固醇和血脂的作用，可预防或减轻脉粥样硬化症[26]。这些化合物使东北特产大酱保质期较长，且具有较高的营养价值。

3 结论

本研究对固相微萃取法中的提取时间和提取温度进行了优化，结果表明，提取时间为40 min、提取温度为60 ℃时对东北特产大酱的挥发性成分提取效果较好。经GC-MS分析，从东北特产大酱中共分离鉴定出28种挥发性成分，相对含量占总流出物的89.02%；包括酮类、酸类、醇类、酯类、酚类、醛类等，相对含量＞1%的成分有：3-乙酰基-6-甲基-2,4-吡喃二酮（53.38%）、乙醇（12.93%）、苯甲酸（7.78%）、乙酸（5.26%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（1.93%）、苯甲酸乙酯（1.48%）。

根据研究相关酱类挥发性成分的文献报道[24，27-28]和鉴定出的挥发性成分的香气特征及其阈值，得出苯乙醛、3-辛酮、2,3,5,6-四甲基吡嗪、愈创木酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等挥发性成分对东北特产大酱整体香气贡献较大，赋予了东北特产大酱特有的香气。与相关文献[7]相比，此次检出了对整体香气贡献较大的2,3,5,6-四甲基吡嗪。

醛类化合物赋予了东北特产大酱赋予了大酱坚果香、青香和瓜果香，酯类化合物赋予了大酱赋予了东北特产大酱果香、甜香和酯香，酮类和醇类化合物赋予了大酱果香、草香，酚类和其他类化合物赋予了大酱辛香、酱香、烤香，使大酱整体香气透发。此外，有的挥发性成分还具有防腐抑菌、抗氧化、降血脂等作用。

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