他拉达非对肺动脉高压模型大鼠降钙素基因相关肽、p27及 p-ERK1／2表达的影响

姜波

（济宁医学院附属医院胸外科，山东 济宁 272000）

他拉达非对肺动脉高压模型大鼠降钙素基因相关肽、p27及 p-ERK1／2表达的影响

姜波

（济宁医学院附属医院胸外科，山东 济宁 272000）

目的 分析他拉达非对肺动脉高压模型大鼠降钙素基因相关肽（CGRP）、p27及p-ERK1／2表达的影响。方法 将36只雄性SD大鼠随机分为肺动脉高压（PAH）组（A组），他拉达非组（B组）及对照组（C组），各12例。观察各组大鼠血流动力学及肺血管形态学变化，以Western Blot法分析肺动脉CGRP，p27及p-ERK1／2的表达。结果 与A组比，B组聚天冬氨酸（PASP）、平均肺动脉压（mPAP）显著降低(P＜0.05)，游离右室壁（RV）／（左室+室间隔）（LV+S）在 A，B组间无显著性差异（P＞0.05），但均显著高于 C组(P＜0.05)；A组右心室肥大程度及肺血管结构变化显著高于B组(P＜0.05)，且均显著高于C组(P＜0.05)；A组大鼠CGRP，p27表达显著降低(P＜0.05)，p-ERK1／2表达显著上调(P＜0.05)，经他拉达非干预后改善，但与C组相比，差异仍有统计学意义(P＜0.05)。结论 他拉达非能显著改善PAH模型大鼠的血管重构，CGRP及ERK1／2／p27在其中可能扮有重要作用。

他拉达非；肺动脉高压；降钙素基因相关肽；血管重构

肺动脉高压（PAH）是以平滑肌细胞增生、肺血管收缩及重构为特征的疾病，能引起患者右心室肥厚、肺血管阻力增加最终导致患者右心衰竭和死亡。近年的研究显示，血管重构是PAH发生和发展的重要病理生理机制，肺动脉平滑肌细胞的过度增殖与迁移是引起血管重构的关键因素[1]。降钙素基因相关肽（CGRP）是感觉神经的重要递质，是目前已知最强的舒血管物质，在调节血管阻力和维持血压稳定等方面有重要作用[2]，而p27及ERK1／2参与的信号通路在调节血管平滑肌细胞增殖及血管重构方面亦有重要作用。他达拉非为5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂，广泛应用于治疗肺动脉高压，但其作用机制尚未完全明了。本研究中基于CGRP具有降压及抑制血管重构的作用，探讨了 CGRP及ERK1／2／p27在他达拉非降低肺动脉高压、预防缓解肺血管重构中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：Model680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；BL-410型多功能生理记录仪（成都泰盟科技有限公司）；Mini PROTEAN电泳系统（美国Bio-Rad公司）。

试药：盐酸他达拉非片（美国 Elilillyand公司，国药准字H20120472，规格为每片 20 mg)，药片粉碎后溶于 10 mL生理盐水备用；野百合碱（MCT，Sigma公司，批号为063K1183)，溶于1 mol／L稀 HCl溶液，制成1% 浓度溶液，调pH至7.2，加生理盐水配制成10 g／L MCT溶液。兔抗鼠CGRP多克隆抗体（美国Sigma公司）；小鼠抗大鼠p27单克隆抗体、小鼠抗大鼠ERK1／2单克隆抗体、小鼠抗大鼠p-ERK1／2单克隆抗体、小鼠抗大鼠GADPH单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。

动物：36只健康雄性SD大鼠，SPF级，体重180～200 g，由南方医科大学动物实验中心提供，许可证号SCXK（粤）2011-0015。动物饲养及所有操作流程均遵守《实验动物管理条例》，可自由进食及饮水。

1.2 方法

动物模型建立：适应性饲养5 d后，将36只雄性SD大鼠随机分为3组，每组12只，A组为MCT诱导肺动脉高压（PAH）组，B组为他达拉非组，C组为对照组。A组、B组大鼠给予皮下注射已配制好的MCT溶液60 mg／kg，C组给予腹部注射相应剂量生理盐水，相同条件下喂养，自由饮食、饮水。4周后，动物模型经胸体彩超鉴定后，B组大鼠给予0.5 mg／(kg·d)他达拉非溶液灌胃处理，A组、C组给予相同剂量生理盐水灌胃处理，相同条件饲养4周后，取材进行相关检测。

血流动力学及右心室肥厚病变分析：试验中大鼠水合氯醛腹腔麻醉后将右心导管预充肝素盐水后与压力换能器相连，用20号套管针经右心室穿刺至肺动脉主干记录肺动脉收缩压（PASP）及平均肺动脉压（mPAP）；处死大鼠，结扎主动脉，取心、肺，经生理盐水漂洗后结扎肺动脉，分离心脏，秤取游离右室壁和左室+室间隔质量（RV，LV+S），计算右心肥厚指数RV／(LV+S)。

肺血管形态学观察：石蜡包埋固定并切片，将切片经HE染色后置于显微镜下观察，随机选取直径50～150 μm肺小动脉标本，用图像分析技术计算肺血管内外管径均值，管壁厚度(WT)，膜厚度占管腔比例(WT，%)=2×WT／ED，管壁横截面面积占管腔面积的比例(WA，%)=（TA-IA）／TA。

Western Blot法分析 CGRP，p27及 ERK1／2表达水平：在液氮中将肺动脉研磨成粉末加200 μL裂解液（50 mmol／L Tris-HCl pH=8.0，150 mmol／L PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制剂）。4℃12 000 r／min离心 15 min，取上清，采用 Bradford法检测蛋白浓度；取上述制备的蛋白样品50 μg上样到15%SDS-PAGE凝胶，电泳完毕后将蛋白电转至NC膜，用5%脱脂奶粉封闭，分别加一抗，37℃孵育2 h，经0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X线胶片定影，扫描后用IPP 6.0进行图像分析。

1.3 统计学处理

2 结果

结果见表1和表2，图1和图2。

表1 3组大鼠血流动力学及右心肥厚指数比较（±s，n=12）

表1 3组大鼠血流动力学及右心肥厚指数比较（±s，n=12）

组别A组B组C组PASP（mmHg）39.06±6.61β＃31.04±4.02β27.96±3.07 mPAP（mmHg）24.16±2.39β＃20.11±2.06β12.92±1.71 RV／（LV+S）（%）44.28±5.34β34.92±6.11β28.14±5.96

注：与C组比较，βP＜0.05；与B组比较，＃P＜0.05。下表同。

表2 3组大鼠肺动脉结构变化比较（±s，n=12）

表2 3组大鼠肺动脉结构变化比较（±s，n=12）

组别A组B组C组WT(%) 36.51±6.04β＃26.91±5.17β18.06±3.26 WA(%) 56.71±5.28β＃41.64±4.63β28.53±4.17

图1 3组大鼠肺血管形态图（HE，×200）

3 讨论

PAH是指累及肺小动脉且以平滑肌与肺血管内皮细胞异常增生为特点的一种肺血管疾病，随着疾病的发展，可导致患者右心室压力增大，出现扩张、肥大，心室对血液动力压力反应减弱[3]，最终导致患者右心衰竭死亡。随着研究的深入，发现剪切力、缺氧、炎症及药物刺激能使肺血管内皮细胞结构、功能及代谢发生紊乱，启动 PAH的发生[4]。血管内皮损伤破坏了其屏障作用，干扰了平滑肌细胞与内皮细胞间的内皮-肌连接作用，促进肺血管平滑细胞过度增殖，引发肺血管重构[5]。而在肺血管重构的过程中细胞周期调控相关因子在其中发挥重要的作用，p27作为细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的负调节因子，能通过抑制 cyclin／CDK复合物的磷酸化，降低其活性，阻止细胞过度增殖。动物试验研究[6]显示，激活 ERK1／2信号通路可促进 p27的降解，导致细胞进入细胞增殖周期。Qin等[7]的研究结果显示，在肺动脉平滑肌及细胞中CGRP能显著抑制血管紧张素Ⅱ的表达，而ERK1／2在此过程中被激活。

图2 Western Blot法分析各组CGRP，p27及ERK1／2表达

目前，PAH治疗的选择一般包括药物治疗、介入及外科治疗，其中药物治疗包括钙离子拮抗剂、内皮素受体拮抗剂等肺动脉血管扩张剂，通过阻断肺动脉高压发病的不同环节起作用，取得了较好的疗效。但介入及外科治疗，包括肺移植、心肺联合移植及经皮球囊房间隔造口术，手术风险大，术后并发症多[8]。他达拉非为新型长效、具有选择性的磷酸二酯酶抑制剂，具有较好的耐受性，能长时间扩张血管，提高运动耐量，降低恶化发生率，可显著改善患者的生活质量[9]。

本研究中，采用野百合碱建模，且后期对大鼠血流动力学变化及右心肥厚指标分析，结果显示PAH模型组RVSP及mPAP显著增高，他拉达非干预后下降但仍高于对照组，提示采用野百合碱造模成功。RV／（LV+S）在模型组和干预组无显著性差异，但均显著高于对照组，提示造模过程大鼠已经出现右心结构异常。光镜下模型组肺动脉血管内皮细胞重症脱落，管腔不规则增厚，狭窄甚至闭塞，管腔内残留大量红细胞，肺泡腔内见大量炎性细胞浸润。WA及WT%结果提示，经他拉达非干预后，肺小血管重构得到改善。Western Blot法分析结果证实，A组CGRP，p27显著降低，而 p-ERK1／2表达显著升高，与 Zhang等[10]的研究结果一致，内源性CGRP的消耗能加重PAH血管重构，其作用机制可能与抑制ERK1／2磷酸化，进而上调p27的表达有关。

综上所述，他拉达非能显著改善PAH模型大鼠的血管重构，CGRP、p27及ERK1／2在其中可能具有重要作用。

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Expression of CGRP,p27 and p-ERK1／2 in Tadalafil-Intervened Pulmonary Arterial Remodeling Rats

Jiang Bo
(Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital to Jining Medical College,Jining,Shandong,China 272000)

Objective To analyze the expression of CGRP,p27 and p-ERK1／2 in Tadalafil-intervention pulmonary arterial remodeling rats.M ethods 36 male SD rats were randomly divided into PAH model group(A),Tadalafil-intervention group(B)and control group (C),the blood flow dynamics and rats pulmonary vascular morphology change were observed,the expressions of pulmonary CGRP,p27 and p-ERK1／2 were analyzed.Results Compared with model group,the intervention group PASP,mPAP significantly reduced(P＜0.05),RV／(LV+S)had no significant difference(P＞0.05),but both were higher than control group(P＜0.05);the model rats right ventricular hypertrophy and pulmonary vascular structural changes was significantly higher than the intervention group(P＜0.05); CGRP,p27 expression in model group was significantly reduced,p-ERK1／2 expression significantly increased(P＜0.05),after Tadalafl intervention significantly improved,but also has a significant difference with control group(P＜0.05).Conclusion Tadalafil significantly improve PAH model rat vascular remodeling,CGRP,ERK1／2／p27 may play an important role.

tadalafil;pulmonary hypertension;CGRP;ERK1／2

R965；R972+.4

A

1006-4931(2015)23-0027-03

姜波，大学本科，主治医师，主要从事胸外科工作，（电子信箱）bojiang1214＠163.com。

2015－07－23)