钙离子拮抗剂维拉帕米对人食管下括约肌舒缩的调节机制

吴瑞锋刘俊峰高杨李保庆王金栋刘新波

钙离子拮抗剂维拉帕米对人食管下括约肌舒缩的调节机制

吴瑞锋1刘俊峰2高杨3李保庆2王金栋4刘新波2

目的通过比较钙离子拮抗剂维拉帕米对由乙酰胆碱诱导的人食管下括约肌（LES）套索纤维和钩状纤维肌条收缩的拮抗程度，探讨维拉帕米对LES肌条舒缩的影响。方法应用中上段食管癌患者LES作为研究对象，同时取食管体部和胃底肌条作为对照。分离出食管体部、胃底、套索纤维（sling）和钩状纤维（clasp）肌束，应用离体肌条张力测定技术分别测定维拉帕米（10－3mol／L）对由乙酰胆碱（Ach）（浓度分别为10－6、10－5、10－4、10－3、10－2、10－1mol／L）诱导的4种肌条收缩的拮抗程度。结果食管环行肌组、胃底环形肌组和clasp组加入维拉帕米前后未见肌条收缩水平有明显改变（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747；t＝2.294，P＝0.023）。sling组加入维拉帕米后，收缩能力下降，收缩水平由（17.0±5.2）g降至（14.7±6.6）g，差异有统计学意义（t＝2.294，P＝0.023）。结论维拉帕米部分阻滞了LES套索纤维的收缩，从而导致了LES的舒张。

钙离子； 食管； 括约肌； 维拉帕米

人食管下括约肌（the lower esophageal sphincter，LES）［1］由套索纤维（sling fibers）和钩状纤维（clasp fibers）共同构成。这两束肌肉共同维持LES的关闭状态，并形成了LES高压带（high－pressure zon，HPZ）（15～30mmHg）（1mmHg＝0.133kPa）［2－3］。LES有自发产生基础张力的特性，由此张力阻止胃内容物反流入食管内。

有关LES的舒缩调节机制仍是食管生理研究的热点。目前临床上应用钙离子（Ca2＋）拮抗剂治疗贲门失迟缓症等食管运动功能障碍性疾病，虽有一定的效果但并不能根本缓解，即使采取手术治疗，很多患者术后仍有残余症状甚至复发［4］。本研究应用离体肌条张力测定技术分别测定Ca2＋拮抗剂维拉帕米对由乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）诱导的4种肌条收缩的拮抗程度，探讨Ca2＋拮抗剂对人LES舒缩过程的影响，进一步探索LES舒缩的调节机制，为临床治疗食管运动功能障碍性疾病提供理论依据。

材料与方法

一、标本制备

选取我院2013年5月至2015年4月收治的食管中上段癌行食管大部切除术患者6例，其中男女各3例，平均年龄56岁。所有患者术前均无烧心、反酸症状，亦无贲门失弛缓症、硬皮病等可能导致LES功能障碍的疾病史。由于肿瘤位于食管中段或上段未累及胃食管连接部，所取胃食管连接部的标本可认作近似正常。手术室采集新鲜手术标本后，立即放入4℃Krebs液中，送入实验室。Krebs液含NaCl 118.1mmol／L、KCl 4.7mmol／L、CaCl22.5mmol／L、MgSO41.2mmol／L、KH2PO41.2 mmol／L、NaHCO324.9mmol／L、葡萄糖10.0 mmol／L，pH值7.4。于室温下将标本黏膜面向上固定于盛有Krebs液的蜡盘中，持续通以5%CO2和95%O2混合气体。锐性剥去胃贲门部及食管下段的黏膜层及黏膜下层后，在胃的大弯侧及小弯侧可分辨出两个增厚的半环形平滑肌带，分别为clasp和sling。然后在解剖显微镜下小心游离这两束纤维及食管体部环行肌和胃底环行肌，制备成（0.5～1.0）cm×（0.1～0.2）cm的肌条，并在显微镜下观察为正常平滑肌组织才能使用。本实验经河北医科大学第四医院伦理委员会批准，并获患者及家属知情同意。

二、实验步骤

实验分为钩状纤维组（clasp）、套索纤维组（sling）、食管环行肌组和胃底环行肌组，分别将获得的4个部位的肌条两端以0号手术丝线扎紧，悬挂于已去除CaCl2的Krebs液（10ml）的离体器官灌流槽（南京美易科技有限公司）中，37℃恒温，持续通以5%CO2和95%O2混合气体。肌条下端固定，上端连接于JZ101型肌肉张力换能器（河北省新航机电设备有限公司），将换能器固定杆固定于可精确调节的升降架上，由Medlab离体器官检测仪（南京美易科技有限公司）测定肌条张力，张力信号放大后经Medlab信号采集系统（南京美易科技有限公司）记录。平滑肌条固定好后，先温浴1h，每20min更换已去除CaCl2的Krebs液一次。然后缓慢牵拉肌条，以刚好将肌条拉紧后的长度为初始长度（L0），在这一长度时松弛肌肉不会产生明显的张力变化，而进一步牵拉则会使张力明显升高。然后，多次缓慢牵拉肌条，每次增加其初始长度的25%～50%，待被动张力稳定10min后再次牵拉。如此反复，约每20min牵拉一次，直至达到初始长度的200%为最适初长度。随后进行的实验均在此条件下进行。

待最适初长度稳定40min后，以浓度累积方式依次向浴槽中加入Ach（10－6、10－5、10－4、10－3、10－2、10－1mol／L），每增加一个浓度，都要在前一浓度达到最大反应时加入，记录张力变化值。浓度累积方式给药所作的浓度反应曲线与单独浓度给药方式类似。彻底冲洗肌条，加入维拉帕米（取维拉帕米的最适有效浓度为10－3mol／L）1min后，再以上述方式加入Ach，分别记录四组的肌条张力变化值。试验完毕，取出肌条用滤纸吸干外附水分，用精密分析天平称重，将所得张力变化值结合标本重量、初始长度及标准密度，换算出单位横截面积张力值（mN／mm2）。

三、统计学分析

所得数据应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用随机区组设计实验的方差分析（析因分析）进行统计学检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

食管环行肌、胃底环行肌、clasp、sling四组在不同浓度Ach诱导下加入维拉帕米后肌条收缩情况如图1～4所示。其中食管环行肌、胃底环行肌和clasp三组的肌条在加入维拉帕米后收缩幅度与未加入前比较差异无统计学意义（（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747；t＝2.294，P＝0.023）；但sling组的肌条收缩在加入维拉帕米后受到抑制，肌束张力由（17.0±5.2）g降至（14.7±6.6）g，差异有统计学意义（t＝2.294，P＝0.023）（表1）。

图2 胃底环行肌组加入维拉帕米前后肌条的收缩情况

图3 clasp组加入维拉帕米前后肌条的收缩情况（n＝6）

图4 sling组加入维拉帕米前后肌条的收缩情况（n＝6）

表1 加入维拉帕米前后4种肌条的收缩情况比较（n＝6，±s，g）

表1 加入维拉帕米前后4种肌条的收缩情况比较（n＝6，±s，g）

组别加阻滞剂前加阻滞剂后t值P值食管环行肌组14.6±4.2 14.0±3.2 0.896 0.372胃底环行肌组16.0±7.8 15.6±7.8 0.331 0.741 Clasp组15.6±6.0 15.3±6.0 0.324 0.747 Sling组17.0±5.2 14.7±6.6 2.294 0.023

讨 论

Ca2＋拮抗剂在临床上应用广泛，主要应用于心脑血管疾病，在消化系统疾病中主要用于治疗贲门失弛缓症。常用药物为硝苯地平［5］和维拉帕米，作用机制是阻滞外源性Ca2＋经L－型钙离子通道进入细胞内，降低胞内的Ca2＋浓度，而Ca2＋是细胞内重要的第二信使，高浓度的Ca2＋可引起平滑肌收缩，低浓度Ca2＋可引起平滑肌舒张［6］。

人LES由sling和clasp共同构成。LES的压力是不对称的，高压区偏向左侧sling方向［7］。应用毒蕈碱受体拮抗剂阿托品可明显降低LES左侧的压力［1，8］，且体外实验也证明sling对Ach的敏感度更高，但钩状纤维却有更大的自发张力［9－10］，表明clasp和sling在LES中存在不同的舒缩信号转导机制。高立平、温士旺等［11－13］在对人LES的一系列研究中已经证明sling起到了主要作用。细胞内Ca2＋浓度的变化是导致两种肌条对Ach反应不同的原因，而这种不同与毒菌碱受体的亚型无关［1，7］。

本实验研究结果表明Ca2＋拮抗剂维拉帕米主要作用于sling，即维拉帕米不能完全阻滞clasp和sling由Ach诱导的收缩，但维拉帕米可明显降低sling收缩的程度，也就是部分地阻滞了sling的收缩，从而导致LES的舒张。

本研究结果与以往的相关研究不同，甚至相反。如在Ach对人LES肌细胞收缩作用和细胞内Ca2＋浓度的影响研究中发现，Ca2＋拮抗剂硝苯地平明显降低了clasp平滑肌细胞内Ca2＋浓度的升高幅度，而sling组则基本不受硝苯地平的影响，即硝苯地平阻滞了clasp却不能阻滞sling的收缩反应［5，14］。Muinuddin等［15］在对猫LES的环形肌和sling Ca2＋源的多样性的研究中发现环行肌收缩被阻滞的程度远大于sling；应用L型钙离子通道阻滞剂时，环行肌被阻滞而sling的收缩却不受影响。

综合以上各因素分析导致本实验结果变化的原因如下：①LES在由Ach诱导的收缩过程中其不同肌组织利用钙源的程度不同，sling主要依靠了外钙内流，且流经L型钙离子通道，而clasp则主要依靠细胞内存储的Ca2＋的释放；②Ca2＋不止是通过L－型钙离子通道进入细胞内，也可能经T型钙通道进入细胞内［16］；③LES的舒缩调节除受Ca2＋影响外，还受神经、体液、内分泌等多种因素不同调节机制的影响。结合临床实践，这也验证了Ca2＋拮抗剂并不能根治贲门失弛缓症，而只是部分缓解症状的原因。因此，更深入地了解Ca2＋在LES舒缩过程中所起的作用、方式及研发出针对不同钙源的阻滞剂，会为食管良性疾病的内科保守治疗带来坚实的理论基础。

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5 Tsuboi K，Hoshino M，Srinivasan A，et al.Insights gained from symptom evaluation of esophageal motility disorders：a review of 4 215patients［J］.Digestion，2012，85（3）：236－242.

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Regulation mechanism of contraction and relaxation of human lower esophageal sphincter by calcium antagonist verapamil

Wu Ruifeng1，Liu Junfeng2，Gao Yang3，Li Baoqing2，Wang Jindong4，Liu Xinbo2.
1Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery，the First Central Hospital of Baoding，Baoding 071000，China；2the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；3School of Postgraduate，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；4Department of Cardiothoracic Surgery，the First People’s Hospital of Xuzhou，Xuzhou 221002，China

Liu Junfeng，Email：liujf＠heinfo.net

ObjectiveTo investigate the effects of calcium antagonist verapamil on the contraction and relaxation of human lower esophageal sphincter（LES）clasp and sling fibers induced by acetylcholine（Ach）.MethodsLES was obtained from patients with superior and middle esophageal carcinoma，and muscles of esophageal body and gastric bottom were served as controls.After isolation of muscle bundles of esophageal body，gastric bottom，sling fibers and clasp fibers，in vitro muscle stripe intensity measurement technique was employed to determine the effects of verapamil（10－3mol／L）on the contraction and relaxation of these four muscle stripes induced by Ach（10－6，10－5，10－4，10－3，10－2and 10－1mol／L）.ResultsThe contraction of circular muscles of esophageal body and gastric bottom and clasp fibers was not significantly changed after verapamil intervention（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747）.However，the contraction of sling fibers was significantly decreased from（17.0±5.2）g to（14.7±6.6）g after verapamil intervention（t＝2.294，P＝0.023）.ConclusionsVerapamil partly blocks the contraction of LES，and results in the relaxation of LES.

Calcium iron； Esophagus； Sphincter； Verapamil

2015－04－29）

（本文编辑：周珠凤）

10.3877／cma.j.issn.2095－8773.2015.03.004

河北省自然科学基金资助项目（C2010000622）

071000 保定市第一中心医院心胸血管外科1；050011 石家庄，河北医科大学第四医院胸外科2；050011石家庄，河北医科大学研究生学院3；221002 徐州市第一人民医院胸心外科4

刘俊峰，Email：liujf＠heinfo.net

吴瑞锋，刘俊峰，高杨，等.钙离子拮抗剂维拉帕米对人食管下括约肌舒缩的调节机制［J／CD］.中华胸部外科电子杂志，2015，2（3）：157－160.