协同刺激分子B7-H3在自发性流产患者中的表达及生物学意义

李采霞　曹森杨　温开群　张弘

作者单位: 224002江苏省盐城市妇幼保健院(李采霞、曹森杨、温开群);江苏大学第二附属医院妇产科(张弘)

协同刺激分子B7-H3在自发性流产患者中的表达及生物学意义

李采霞曹森杨温开群张弘

作者单位: 224002江苏省盐城市妇幼保健院(李采霞、曹森杨、温开群);江苏大学第二附属医院妇产科(张弘)

【摘要】目的研究可溶性B7-H3(sB7-H3)在正常、妊娠、自发性流产和复发性流产外周血血清中的含量，同时研究B7-H3在正常妊娠行人工流产者(孕3个月内)和自发性流产者(流产后3个月内)的绒毛膜和蜕膜表达情况，探讨协同刺激分子B7-H3在妊娠免疫中的生物学意义。方法利用ELISA的方法分析sB7-H3在正常未孕者、正常妊娠者、自发性流产者、复发性流产者血清含量。收集正常妊娠行人工流产术组的绒毛膜和蜕膜以及自发性流产组的绒毛膜和蜕膜，通过免疫组化的方法，分析B7-H3在不同组织中的表达情况。结果sB7-H3在正常对照组、妊娠组、自发性流产组、复发性流产组的血清标本的平均含量之间差异有统计学意义(P＜0.05)。人工流产组和自发性流产组中B7-H3在绒毛膜的表达差异无统计学意义(P＞0.05);在蜕膜上的表达人工流产组明显高于自发性流产组(P ＜0.05); B7-H3在绒毛膜局部表达，在蜕膜组织各处均有表达。结论B7-H3参与了妊娠免疫，并与自发性流产的发生相关。

【关键词】B7-H3;共刺激分子;自发性流产;妊娠

B7-H3，又称CD276，是免疫共刺激分子B7超家族的成员之一［1，2］。Baxter等［3］从DC的cDNA库中克隆出B7家族的新成员: B7-H3。序列分析推测B7-H3是个有316个氨基酸的I型跨膜蛋白。含有N末端信号肽，1个IgV样区，1个IgC样区，1个跨膜蛋白区和1个45个氨基酸的胞质尾。B7-H3的表达异常与多种疾病如感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤有一定的相关性。而且B7-H3呈现出膜型和可溶性两种表达形式。为了探讨B7-H3与自发性流产的相关性，我们在苏州大学医学生物技术研究所制备研制的B7-H3检测试剂盒的基础上［4，5］，对正常人、正常妊娠者(3个月内)、自发性流产(流产后3个月内)及复发性流产(流产后3个月内)患者血清中sB7-H3水平进行分析。另外收集了正常早期妊娠行人流术者(孕3个月内)和自发性流产者(流产后3个月内)的绒毛膜蜕膜和组织，通过免疫组化的方法，分析B7-H3在其中的分布，进一步研究其相关性。

1　资料与方法

1.1一般资料本研究收集正常未孕者37例、正常妊娠者123例(孕3个月内)、自发性流产者147例(流产3个月内)、复发性流产者44例(流产3个月内)。平均年龄分别为(23.2±2.9)、(25.9±2.3)、(27.3±2.3)、(28.2±2.3)岁。排除其他基础疾病。4组年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)。组织标本:收集正常妊娠行人工流产术组的绒毛膜(19例)和蜕膜(20例)以及自发性流产组的绒毛膜(21例)和蜕膜(21例)。行免疫组化分析。以上标本来自2011年8月至2013年7月苏州大学第二附属医院妇产科住院部。

1.2试剂抗人B7-H3单抗ELISA检测试剂盒(苏州大学医学生物技术研究所制备研制);免疫组织化学所用的B7-H3单克隆抗体均由苏州大学生物技术研究所制备(使用浓度为10 μg/ml);免疫组化分析所用二抗:辣根过氧化物酶标记鼠/兔通用型二抗(即用型，福州迈新生物科技有限公司);免疫组织化学常用试剂: PBS缓冲液粉剂;柠檬酸抗原修复液; EDTA抗原修复液; BSA(Gene-tech，Co.Ltd);苏木素体细胞快速染色液; 1%盐酸-酒精分化液; DAB显色剂;封片用中性树胶; 3%H2O2;多聚赖氨酸玻片。

1.3试验方法

1.3.1血清中sB7-H3标准工作曲线的绘制:以sB7-H3重组蛋白的梯度稀释液(5 000、2 500、1 250、625、100、50、25、0 pg/ml)浓度为纵坐标，相应的OD值为横坐标，绘制sB7-H3的标准工作曲线［4，5］。

1.3.2血清中sB7-H3的结果分析:应用已建立的sB7-H3 ELISA检测方法，对正常人、正常妊娠者(孕3个月内)、自发性流产(流产后3个月内)患者及复发性流产(流产后3个月内)的血清样本中sB7-H3的含量进行定量分析。

1.3.3免疫组织化学染色:收集正常妊娠行人工流产术组的绒毛膜(19例)和蜕膜(20例)以及复发性流产组的绒毛膜(21例)和蜕膜(21例)，行免疫组化分析。具体标准见表1［6］，总分: X×Y。

表1　免疫组化实验评分标准

1.4统计学分析采用GraphPad Prism 5软件，计量资料以x±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1B7-H3工作曲线的建立B7-H3标准品蛋白浓度蛋白浓度与OD450值之间具有良好线性关系。检测范围为0～5 000 pg/ml。结果显示相关系数R2=1.0000，其浓度和OD值呈现明良好的相关性。见图1。

图1　人可溶性sB7-H3 ELISA检测试剂盒中的标准曲线

2.2血清样本中sB7-H3的ELISA结果分析我们的结果显示:妊娠组血清中sB7-H3的含量为(2 023± 98)pg/ml;复发性流产组为(768±52)pg/ml;正常组为(595±49)pg/ml;自发性流产组为(1 000± 42)pg/ml(表2)。即血清样本中sB7-H3含量为妊娠组＞自发性流产组＞复发性流产组＞正常对照组(P ＜0.05)。见图2。

图2　sB7-H3血清含量分类图

2.3免疫组化结果分析根据免疫组化的评分标准，我们对B7-H3在组织中的表达进行分析。B7-H3绒毛膜组仅在绒毛膜局部表达，蜕膜组均全部表达。绒毛膜样本中B7-H3表达平均评分为正常妊娠行人工流产组(1.842±0.491)、自发性流产组(1.550± 0.467);蜕膜标本中B7-H3表达平均评分为妊娠组(3.950±0.626)、流产组(2.286±0.437)。绒毛膜组B7-H3在人工流产(即正常妊娠3个月内)和自发性流产中均有表达，但差异无统计学意义(P＞0.05)。蜕膜组的B7-H3评分在人工流产组显著高于自发性流产组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2，图3 ～5。

3　讨论

图3　免疫组化实验B7-H3在绒毛膜的表达强度

图4　B7-H3在绒毛膜中表达情况分析

图5　B7-H3在蜕膜中表达情况分析

表2　蜕膜样本中B7-H3的评分测定和分析　分，x±s

妊娠相当于同种异体移植，胎儿及其附属物不被母体排斥并可在子宫内发育成熟，母体必须形成免疫耐受。正常妊娠期，母体免疫功能发生变化，在母-胎免疫微环境中，有多种细胞和细胞因子参与这种免疫调节作用。B7-H2、B7-H3在整个妊娠周期滋养细胞中都有表达。B7-DC、B7-H2和B7-H3在母胎界面的时间、组织空间的差异表达诱导母胎免疫耐受的建立和维持［7－9］。本实验主要研究B7-H3在母胎界面的免疫耐受。

目前，B7-H3作为协同共刺激分子其协同刺激和协同抑制的作用都有相关研究报道，B7-H3在免疫反应中具有相反功能，可能是归因于不同细胞的多重受体。故对B7-H3的生物学作用仍存在一定的争议。sB7-H3在非小细胞肺癌(NSCLC)患者体内水平显著高于其他肺部疾病者或者健康人，而且sB7-H3的表达水平与患者肿瘤的分化程度、淋巴结转移以及远端转移密切相关。说明sB7-H3是非小细胞肺癌的一个重要生物标记［10］。sB7-H3在正常人和慢性前列腺患者血清中的水平差异无统计学意义(P＞0.05)，但是在慢性前列腺患者的前列腺分泌物中的水平相较于健康人则有显著性差异。这提示sB7-H3可以作为一个诊断慢性前列腺疾病的指标［4］。Sun等［11］发现，鼠B7-H3不论在体内还是体外，均具有负向调节作用，能够抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生。

本实验研究B7-H3与自发性流产的相关性，通过ELISA实验，分析了正常人、正常妊娠者、复发性流产者、自发性流产者的血清中可溶性sB7-H3差异性表达的结果。并再通过免疫组化实验分析膜型B7-H3在绒毛膜和蜕膜中的表达，进一步证实其相关性。实验结果表明:外周血血清中sB7-H3含量是正常妊娠者＞自发性流产＞复发性流产＞正常未孕者，我们推测B7-H3是正常人体内存在的一种协同刺激分子，经过妊娠这个特殊的生理过程，其含量急剧升高。复发性流产和自发性流产都是先经历妊娠过程，而后发生了流产这样的结局，其外周血中sB7-H3含量都是要高于正常人，而低于正常妊娠者的。复发性流产后，其发生流产的易感性增加，外周血中sB7-H3含量低于自发性流产。根据以上的分析，我们认为B7-H3是对保证正常妊娠过程有积极作用一种因子，可能是因为其在正常妊娠过程中发挥了其负性调节作用，减轻了母体对胎儿的免疫排斥，保证了妊娠的继续维持。

本实验结果表明，基于正常妊娠行人工流产者和自发性流产者都是经历早期妊娠过程的，而绒毛膜是维持早期妊娠的一种重要物质，早期妊娠的绒毛膜局部表达B7-H3。蜕膜是早期妊娠继续发育后出现的组织，正常妊娠行人工流产者和自发性流产者的B7-H3在蜕膜的表达存在显著性差异，一定程度上预示了自发性流产的结局发生。B7-H3是妊娠过程中表达量增加的协同刺激因子，其表达量增加的程度也在一定程度上影响了最终的妊娠结果。

综上，我们认为B7-H3是一种正常表达在人体外周血、绒毛膜和蜕膜的协同刺激因子，随着妊娠过程的发生，其在外周血中的可溶性sB7-H3含量增加，蜕膜上的膜型B7-H3含量增加，绒毛膜上膜型B7-H3含量无显著变化。正常妊娠者的外周血中的可溶性sB7-H3含量和蜕膜上的膜型B7-H3含量增加要显著高于自发性流产者，随着流产次数的增加，B7-H3的增加幅度减小，一定程度上预示了妊娠的结局走向。这在临床工作中对流产发生的可能性方面提供警示，对于减少或者避免流产的发生具有积极意义。

参考文献

1 Jiang L，Liang JY，Jiang MG，et al.Functional polymorphisms in the NBS1 gene and acute lymphoblastic leukemia susceptibility in a Chinese population.Eur J Haematol，2011，86: 199-205.

2 Hakon R，Kimberley JH，Anne M，et al.Primary human acute myelogenous leukemia cells releasematrix metalloproteases and their inhibitors: release profile and pharmacological modulation.Eur J Haematol，2009，84: 239-251.

3 Baxter AG，Hodgk in PD.Activation rules: the two signal theories of immune activation.Nat Rev Immunlo，2002，2: 439-446.

4 Wei X，Zhang G，Yuan H，et al.Detection and quantitation of soluble B7-H3 in expressed prostatic aecretions: a novel marker in patients with chronic prostatitis.J Urol，2011，185: 532-537.

5 Yuan H，Wei X，Zhang G，et al.B7-H3 over expression in prostate cancer promotes tumor cell progression.J Urol，2011，186: 1093-1099.

6 Khorana A，Ahrendt SA，Ryan CK，et al.Tissue factor expression，angiogenesis，and thrombosis in pancreatic cancer.Clin Cancer Res，2007，13: 2870-2875.

7 Hunt JS，Petroff MG，Burnett TG.Uterine leukocytes: key players in pregnancy.Semin Cell Dev Biol，2000，11: 127-137.

8 蔡琳，李大金，孙晓溪，等.孕早期人母-胎免疫耐受机制的研究.中国免疫学杂志，2000，16: 200-202.

9 Hunt JS，Jadhav L，Chu W，et al.Soluble HLA2G circulates in maternal blood during pregnancy.Am J Obstet Gynecol，2000，183: 682-688.

10 Zhang G，Xu Y，Lu X，et al.Diagnosis value of serum B7-H3 expression in non-small cell lung cancer.Lung Cancer，2009，66: 245-249.

11 Sun M，Richards S，Prasad DV，et al.Characterization of mouse and human B7-H3 genes.J Immunol，2002，168: 6294-6297.

Expression and biological significance of costimulatory molecule B7-H3 in patients with spontaneous abortion

LICaixia，CAO Senyang，WEN Kaiqun，et al.
Institute for Maternal and Child Health of Yancheng City，Jiangsu，Yancheng 224002，China

【Abstract】ObjectiveTo observe soluble sB7-H3 levels in serum of peripheral blood in normal women，pregnant women，patients with spontaneous abortion and recurrent spontaneous abortion，and to analyze its expression in chorion and deciduas of artificial abortion women and patients with spontaneous abortion or recurrent spontaneous abortion，and to investigate the biological significance of B7-H3 in order to provide the experimental basis for early diagnosis of spontaneous abortion.Methods The contents of sB7-H3 in serum were detected by ELISA in normal women without pregnancy，normal pregnant women，patients with spontaneous abortion or recurrent spontaneous abortion.The expression levels of B7-H3 in chorion and deciduas of patients with artificial abortion and patients with spontaneous abortion were detected by immunohistochemistry.Results There were significant differences in the serum levels of sB7-H3 among normal control group，normal pregnancy group，spontaneous abortion group，recurrent spontaneous abortion group (P＜0.05).However there were no significant differences in the expression levels of sB7-H3 between artificial abortion group and spontaneous abortion group (P＞0.05).The expression levels of sB7-H3 in deciduas in artificial abortion group were significantly higher than those in spontaneous abortion group (P＜0.05).The expression of B7 could be found in local position of chorion，however，which could found anywhere in deciduas tissue.ConclusionB7-H3 molecule is involved in pregnancy immunization and is correlated to pathogenesis of spontaneous abortion.

【Key words】B7-H3; costimulatory molecule; spontaneous abortion; pregnancy

(收稿日期:2014－10－15)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.006

【文章编号】1002－7386(2015)06－0823－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 392.12