Wnt3a及Lgr5在膀胱癌中的表达及意义

王海东　李景东　常学良　王亚轩　韩振伟　滕志海　黎玮　杨书文

作者单位: 050000石家庄市，河北医科大学第二医院泌尿外科

Wnt3a及Lgr5在膀胱癌中的表达及意义

王海东李景东常学良王亚轩韩振伟滕志海黎玮杨书文

作者单位: 050000石家庄市，河北医科大学第二医院泌尿外科

【摘要】目的探讨Wnt3a、富含亮氨酸重复序列G-蛋白耦联受体(Lgr5)在人膀胱癌组织中的表达和意义。方法应用免疫组织化学法检测11例正常膀胱组织和39例膀胱癌组织Wnt3a、Lgr5蛋白表达情况，RT-PCR方法检测9例正常膀胱组织和17例膀胱癌组织中Wnt3a、Lgr5 mRNA的表达情况。结果免疫组化结果显示: Wnt3a蛋白在膀胱癌与正常膀胱组织表达阳性率分别为79.49%和36.36%，差异有统计学意义(P＜0.05); Lgr5蛋白在膀胱癌与正常膀胱组织表达阳性率分别为74.36%和27.27%，差异有统计学意义(P＜0.05);两者在膀胱癌中的表达呈正相关(r =0.677，P＜0.01)。RT-PCR结果显示: Wnt3a在膀胱癌和正常膀胱组织的光密度比值分别为(0.197± 0.029)和(0.088±0.019)，差异有统计学意义(P＜0.05); Lgr5在膀胱癌和正常膀胱组织的光密度比值分别为(0.408±0.061)和(0.161±0.053)，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论在膀胱癌组织中Wnt3a、Lgr5蛋白及mRNA的表达均高于正常膀胱组织，提示Wnt3a、Lgr5可能与膀胱癌的发生发展密切相关。

【关键词】Wnt3a; Lgr5;膀胱肿瘤; RT-PCR;免疫组化

E-mail: wangyaxuan87@126.com

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，且呈现逐年上升的趋势。世界范围内，膀胱癌的发病率位居全身恶性肿瘤的第九位，男性居第六位［1］。但其发病机制目前还不明确。Wnt信号通路是细胞中高度保守的信号传导途径，参与调节细胞的增殖、分化和凋亡。研究发现，Wnt通路的异常激活与多种人类恶性肿瘤的发生发展密切相关［2］。Lgr5是Wnt信号通路的靶基因，属于G蛋白耦联受体家族的成员，是潜在的肿瘤细胞表面分子标志物。本文观察了Wnt3a、Lgr5在膀胱癌组织中的表达，旨在为膀胱癌的治疗提供新的靶点。

1　资料与方法

1.1一般资料搜集2012年4月至2013年9月在河北医科大学第二医院手术治疗患者中的39例膀胱癌组织和11例正常膀胱组织。标本经多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。同时取膀胱癌组织17例，正常膀胱组织9例于术后立即保存于－80℃中备用。所有标本均经病理证实。

1.2实验试剂琼脂糖购自于美国Sigma公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒、DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司，PCR引物由北京六合华大基因科技有限公司设计提供。兔抗人wnt3a多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗人Lgr5单克隆抗体购自宜康生物技术有限公司，ABC试剂盒购自美国vector公司。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学方法:常规石蜡切片脱蜡水化，PBS洗3次，0.3%H2O2浸泡30 min，微波枸橼酸盐抗原修复，PBS液洗3次，滴加封闭液，室温20 min。滴加一抗室温1 h，PBS洗3次，滴加二抗，室温20 min，PBS洗3次，滴加试剂SABC室温20 min，PBS洗3次，DAB显色，苏木素复染，脱水封片。每例标本同时以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.3.2RT-PCR: Trizol法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度和含量。逆转录反应依照大连宝生物工程有限公司逆转录试剂盒说明书操作。将逆转录产物在PE9600型PCR扩增仪中进行PCR反应。将扩增产物放于琼脂糖凝胶电泳，电泳后于紫外透射仪观察，数码相机照相，采用Quantity One凝胶图像分析软件进行分析，以β-actin电泳作为参照，采用吸光度比值表示结果。

1.3.3结果评定:免疫组化结果判定方法:染色强度分数标准:无色为0分;浅棕色为1分;棕色为2分;深棕色为3分。高倍镜下随机观察5个视野计数阳性细胞数，≤5%为0分; 6%～25%为1分; 26%～50%为2 分;＞50%为3分。将染色强度记分与染色细胞百分数记分相乘，总记分＜2分为阴性; 2～4分为阳性;＞4分为强阳性。

1.4统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料的比较采用χ2检验Fisher’s精确概率法，采用pearson相关分析法进行相关指标分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Wnt3a、Lgr5在膀胱癌、正常膀胱组织中的表达

Wnt3a表达主要分布于细胞质及细胞膜，在膀胱癌组织中表达阳性率明显高于正常膀胱组织，差异有统计学意义(P＜0.05); Lgr5表达主要分布于细胞质，在膀胱癌组织表达阳性率明显高于正常膀胱组织，差异均有统计学意义(P＜0.05);且两者在膀胱癌中的表达呈正相关(r =0.677，P＜0.01)。见表1，图1～4。

表1　Wnt3a、Lgr5在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达　例

图1　正常膀胱组织中Wnt3a的表达(SP×200)

图2　膀胱癌组织中Wnt3a的表达(SP×200)

图4　正常膀胱组织中Lgr5的表达(SP×200)

图5　膀胱癌组织中Lgr5的表达(SP×200)

2.2膀胱癌及正常膀胱组织中Wnt3a、Lgr5在mRNA水平的表达情况为进一步验证Wnt3a、Lgr5在膀胱癌及正常膀胱组织中表达的差异，采用RT-PCR法检测Wnt3a、Lgr5在mRNA水平的表达，Wnt3a在膀胱癌和正常膀胱组织的光密度比值分别为(0.197± 0.029)和(0.088±0.019)，差异有统计学意义(P＜0.05); Lgr5在膀胱癌和正常膀胱组织的光密度比值分别为(0.408±0.061)和(0.161±0.053)，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图5、6。

图5　Wnt3a mRNA在正常组织和膀胱癌中的表达及内参(1～5:为正常组织; 6～13为膀胱癌组织)

图6　Lgr5 mRNA在正常组织和膀胱癌中的表达及内参(1～5:为正常组织; 6～13为膀胱癌组织)

3　讨论

Wnt信号通路，是一条多种分子参与的多环节、多作用位点的复杂的信号转导途径，在细胞的增殖、分化、运动及凋亡等过程中起着重要的调节作用［3］。研究表明，该途径的异常激活与许多疾病有关系，尤其是与恶性肿瘤的发生发展密切相关［4］。

Wnt/β-catenin信号通路属于经典的Wnt信号通路，β-catenin在信号通路中起到核心的作用，启动因子Wnt蛋白家族成员已经发现19种，他们属于富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，通过与细胞表面的特异性受体相互作用，激活下游的信号转导［5］。Wnt3a能够稳定的激活经典Wnt/β-catenin信号通路，因此本实验选用其作为上游目标蛋白。

Lgr5又名GPR49，属于G蛋白耦联受体家族的成员，含有17个富亮氨酸重复序列和7个跨膜结构域，是新近发现的经典Wnt信号通路的靶基因和潜在的肿瘤干细胞的标志物。研究发现，Lgr5在结肠癌、肝细胞癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤中过表达［7］。

Wnt3a通过激活Wnt信号通路，降解复合物的形成，导致β-catenin在胞浆中的降解减少，并转入胞核与Tcf/Lef转录因子家族成员结合，激活Lgr5基因的转录［6］。Lgr5的过量表达可以增强Wnt信号，但其机制目前还不清楚［7］。Malgor等［8］发现Wnt5a在膀胱癌上的表达明显高于正常膀胱组织，且病理分期越高，表达水平越高。有外文报道Wnt7b在非浸润性膀胱癌的早期起到重要作用［9］。Wnt3a在膀胱中的表达鲜有报道。

本研究中，免疫组织化学法显示Wnt3a、Lgr5在膀胱癌中的蛋白表达明显高于正常膀胱组织，且差异有统计学意义。RT-PCR显示膀胱癌组织中Wnt3a、Lgr5 在mRNA水平表达明显升高。Wnt3a、Lgr5两者的表达呈正相关(r =0.677，P＜0.01)。推测Wnt3a的高表达致经典Wnt信号通路异常激活，激活下游靶基因Lgr5的表达，导致细胞的异常增殖、分化和转移;过表达的Lgr5又会增强Wnt信号，进一步促进膀胱肿瘤的发生发展。Barker等［10］发现肿瘤的发生与Lgr5阳性干细胞有关，且Lgr5能启动Wnt信号通路，促进βcatenin表达。

由此我们可以得出，经典Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在膀胱癌的发病中起到重要作用，Wnt3a、Lgr5的高表达与膀胱尿路上皮癌的发生发展密切相关，为膀胱癌的靶向治疗提供新的靶点。但是由于本实验的样本数偏少，未能证明与膀胱癌病理分期的关系，有待进一步实验证明。

参考文献

1 Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell，1993，75: 843-854.

2 Cai C，Zhu X.The Wnt/β-catenin pathway regulates self-renewal of cancer stem-like cells in human gastric cancer.Mol Med Report，2012，5: 1191-1196.

3 Kikuchi A.Roles of Axin in the Wnt signalling pathway.Cell Signal，1999，11: 777-788.

4 Katoh M.Networking of WNT，FGF，Notch，BMP，and Hedgehog signaling pathways during carcinogenesis.Stem Cell Rev，2007，3: 30-38.

5 Dierick H，Bejsovec A.Cellular mechanisms of wingless/Wnt signal transduction.Curr Top Dev Biol，1999，43: 153-190.

6 Mac Donald BT，Tamai K，He X.Wnt/beta-catenin signaling: components，mechanisms，and diseases.Dev Cell，2009，17: 9-26.

7 de Lau W，Barker N，Low TY，et al.Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.Nature，2011，476: 293-297.

8 Malgor R，Crouser S，Greco D，et al.Correlation of Wnt5a expression with histopathological grade/stage in urothelial carcinoma of the bladder.Diagnostic Pathology，2013，8: 139.

9 Bul TD，O’Brien T，Crew J，et al.High expression of Wnt7b in human superficial bladder cancer vs invasive bladder cancer.British Journal of Cancer，1998，77: 319-324.

10 Barker N，Ridgway RA，van Es JH，et al.Crypt stem cells as the cells of origin of intestinal cancer.Nature，2009，457: 608-611.

Expression and significance of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer

WANG Haidong，LI Jingdong，CHANG Xueliang，etal.
Department of Urology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer.Methods

The expression levels of Wnt3a protein and Lgr5 protein wee detected by immunohistochemistry in 11 cases of normal tissues and 39 cases of bladder cancer tissues.The expression levels of Wnt3a mRNA and Lgr5 mRNA were detected by RT-PCR in 9 cases of normal bladder tissues and 17 cases of bladder cancer tissues.Results The results by immunohistochemistry showed the positive expression rates of Wnt3a protein were 84.6%，33.3% in bladder cancer tissues and normal bladder tissues，respectively，there were significant differences between the two kinds of tissues (P＜0.05).The positive expression rates of Lgr5 protein were 84.6%，33.3% in bladder cancer tissues and normal bladder tissues，respectively，there were significant differences between the two kinds of tissues (P＜0.05).The expression of Wnt3a was positively correlated to that of Lgr5 in bladder cancer tissues (r =0.677，P＜0.01).The results by RT-PCR showed that there was a significant difference in the ratio of optical density of Wnt3a between bladder cancer tissues and normal bladder tissues (P＜0.05)，there was a significant difference in the ratio of optical density of Lgr5 between bladder cancer tissues and normal bladder tissues (P＜0.05).Conclusion The expression levels of the protein and mRNA of Wnt3a and Lgr5 in bladder cancer tissues are much higher than those in normal bladder tissues，which suggest that Wnt3a and Lgr5 may be closely related with the pathogenesis and development of bladder cancer.

【Key words】Wnt3a; Lgr5; bladder neoplasms; RT-PCR; immunohistochemistry

(收稿日期:2014－10－22)

通讯作者:王亚轩，050000石家庄市，河北医科大学第二医院泌尿外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.007

【文章编号】1002－7386(2015)06－0826－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 737.14