CXCL12-CXCR4生物轴与卵巢癌关系的动物实验研究

郭清　吴小华　镡丽霞　杨波　吕英璞　徐峰　张少静

作者单位: 050011河北省石家庄市第一医院妇产科(郭清、镡丽霞、吕英璞、徐峰、张少静);中国人民解放军白求恩国际和平医院妇产科(吴小华、杨波)

CXCL12-CXCR4生物轴与卵巢癌关系的动物实验研究

郭清吴小华镡丽霞杨波吕英璞徐峰张少静

作者单位: 050011河北省石家庄市第一医院妇产科(郭清、镡丽霞、吕英璞、徐峰、张少静);中国人民解放军白求恩国际和平医院妇产科(吴小华、杨波)

【摘要】目的探讨CXCL12-CXCR4趋化因子轴与卵巢癌发病的关系。方法将36只裸鼠按照体重大小编号，随机分为3组，将转染质粒SKOV3/CXCR4、转染载体SKOV3/neg及未转染的SKOV3三种卵巢癌细胞进行体外培养，取三种细胞悬液4×106个(200 μl)于裸鼠左下腹注入腹腔，建立荷人卵巢癌细胞裸鼠腹腔移植瘤模型。自注入肿瘤细胞后第2天起，将每组裸鼠又随机分为对照组和处理组，对照组腹腔内注射0.9%氯化钠溶液0.2 ml，处理组腹腔内注射CXCL12-CXCR4拮抗剂AMD3100，观察各组裸鼠自然死亡后腹腔成瘤数、体积、腹水量和存活期的变化。结果SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg及SKOV3三种卵巢癌细胞接种于裸鼠腹腔后1周左右荷瘤裸鼠在对照组和处理组体重差比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。接种SKOV3/CXCR4细胞的裸鼠对照组的平均生存期与CXCR4拮抗剂AMD3100处理组裸鼠比较，差异有统计学意义(Z =－2.29，P＜0.05);而接种SKOV3/neg细胞的裸鼠对照组的平均生存期与CXCR4拮抗剂AMD3100处理组裸鼠比较，差异无统计学意义(P＞0.05);接种SKOV3细胞的裸鼠平均生存期与CXCR4拮抗剂AMD3100处理的裸鼠比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。接种SKOV3/CXCR4细胞裸鼠的对照组腹腔移植瘤的平均个数和平均重量与CXCR4拮抗剂AMD3100处理组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论CXCL12-CXCR4趋化因子轴与卵巢癌的发生有一定的相关性，可能是其发病的一个重要原因，在一定程度上也反映了病情的轻重。

【关键词】CXCL12; CXCR4;卵巢肿瘤

E-mail: xiaohuawu64@ yahoo.com

趋化因子CXCL12与其特异性受体CXCR4构成的CXCL12-CXCR4生物轴在多种肿瘤的播散和器官特异性转移中发挥着重要作用。Kijima等［1］研究证实，CXCL12-CXCR4生物轴与卵巢表面上皮的恶性转化有关，约80%的卵巢癌组织中有CXCL12的受体CXCR4的表达，在95%的卵巢癌腹水中发现CXCL12，而正常的卵巢上皮中却没有表达。本研究以裸鼠为研究对象进行动物试验，来更好地说明两者之间的相关性，为卵巢肿瘤的发病机制提供新的依据，为其治疗提供新的靶点。

1　材料与方法

1.1材料来源

1.1.1肿瘤细胞:卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3由河北医科大学第四医院科研中心提供; SKOV3/CXCR4细胞、SKOV3/neg细胞由本课题组前期制备［2］。

1.1.2实验动物:购自中国医学科学院实验动物中心，合格证编号: SCXK(京)2005-0013。

1.2方法

1.2.1稳定表达趋化因子受体CXCR4卵巢癌细胞株的建立与鉴定:具体构建与鉴定方法参考文献［3］。

1.2.2细胞培养: SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg、SKOV3三种细胞常规培养在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和链霉素100 g/ml的RPMI-1640培养液中; 在37℃、5%CO2条件下孵育;以0.25% (w/v)的胰蛋白酶消化传代。

1.2.3SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg、SKOV3三种细胞裸鼠腹腔移植瘤模型的建立和治疗: 4～6周龄，体重16～18 g，将36只裸鼠按照体重大小编号，随机分为三组，取三种细胞悬液4×106个(200 μl)于裸鼠左下腹注入腹腔。自注入肿瘤细胞后第2天起［4，5］，将每组裸鼠又随机分为对照组和处理组，对照组腹腔内0.9%氯化钠溶液0.2 ml，处理组腹腔内注射CXCR4拮抗剂AMD3100，用量0.01 mg/g，每只裸鼠每次注射0.2 ml;同时每组均腹腔内注射CXCL12 0.2 ml，浓度为100 ng/ml，每2天注射1次，连用2周共7次。

1.2.4荷瘤裸鼠生长状态的观察:荷瘤裸鼠接种细胞后，每日观察裸鼠的精神状况、皮肤、饮食、活动能力等，于移植肿瘤后第7天起隔日测量裸鼠的腹围、体重，观察腹腔移植瘤生长情况，计算2组小鼠的生存天数。

1.2.5荷瘤裸鼠然死亡后的解剖情况:对自然死亡裸鼠进行解剖，检查腹水、心、肝、脾、肺、肾、脑、子宫卵巢、腹膜、横隔、网膜、肠系膜等脏器肿瘤转移情况，同时观察腹腔成瘤数、重量情况。

1.3统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，对各组数据进行单因素方差分析，采用t检验，两两比较应用SNK-q检验，裸鼠平均存活天数的比较采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验，对各组数据组间行配对t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1荷瘤裸鼠的体重对比SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg及SKOV3三种卵巢癌细胞接种于裸鼠腹腔后1周左右荷瘤裸鼠的腹围相无明显的差异，3组裸鼠的对照组和处理组体重差比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1　3种裸鼠的对照组和处理组体重差比较n =6，g±s

表1　3种裸鼠的对照组和处理组体重差比较n =6，g±s

类别　对照组　处理组　t值　P值SKOV3/CXCR4　2.05±0.16　1.94±0.10　－1.22　0.03 SKOV3/neg　2.89.±0.19　2.89±0.23　－0.22　0.83 SKOV3　2.88±0.82　2.92±0.12　2.90　0.28 F值60.84 P值　＜0.05

2.2荷瘤裸鼠的生存及死亡情况接种SKOV3/CXCR4细胞的裸鼠对照组的平均生存期为(15.0± 0.9)d，CXCR4拮抗剂AMD3100处理组裸鼠平均生存期为(17.50±1.64)d，两者比较，差异有统计学意义(Z =－2.29，P＜0.05);接种SKOV3/neg细胞的裸鼠对照组的平均生存期为(16.83±1.33)d，CXCR4拮抗剂AMD3100处理组裸鼠平均生存期为(17.00± 0.89)d，两者比较差异无统计学意义(Z =－0.52，P ＞0.05);接种SKOV3细胞的裸鼠平均生存期为(17.20±1.90)d，CXCR4拮抗剂AMD3100处理的裸鼠平均生存期为(17.17±1.94)d，两者比较差异无统计学意义(Z =－0.25，P＞0.05); 3种裸鼠对照组的平均生存期比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2　2组生存时间比较　n =6，d±s

表2　2组生存时间比较　n =6，d±s

类别　对照组　处理组　Z值P值SKOV3/CXCR4　15.00±0.90　17.50±1.64　－2.29　0.02 SKOV3/neg　16.83±1.33　17.00±0.89　－0.52　0.60 SKOV3　17.20±1.90　17.17±1.94　－0.25　0.81 χ2值48.56 P值　＜0.05

2.3荷瘤裸鼠的腹腔移植瘤情况的对比接种SKOV3/CXCR4细胞裸鼠的对照组腹腔移植瘤的平均个数(87.67±1.86)个，平均重量(3.74±0.11)g，CXCR4拮抗剂AMD3100处理组腹腔移植瘤的个数(80.17±4.58)个，平均重量(2.83±0.10)g，两者相比具有显著性差异(P＜0.05);接种SKOV3/neg细胞的裸鼠对照组腹腔内移植瘤的平均个数为个数(79.17±2.32)个，平均重量(2.82±0.13)g，CXCR4拮抗剂AMD3100处理组腹腔移植瘤的平均个数(79.83±3.25)个，平均重量(2.76±0.11)g，两者比较差异无统计学意义(P＞0.05);接种SKOV3/neg细胞的裸鼠对照组腹腔内移植瘤的平均个数(78.16±1.17)个，平均重量(2.82±0.12)g，CXCR4拮抗剂AMD3100处理组腹腔移植瘤的个数(77.67±3.33)个，平均重量(2.84±0.11)g，两者比较差异无统计学意义(P＞0.05); 3组裸鼠对照组腹腔移植瘤的个数和重量相比差异有统计学意义(P＜0.05); 3组小鼠腹水量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3～5。

表3　对照组和处理组腹腔移植瘤的个数比较n =6，个，±s

表3　对照组和处理组腹腔移植瘤的个数比较n =6，个，±s

组别　对照组　处理组　t值　P值SKOV3/CXCR4　87.7±1.9　80.2±4.6　4.04　0.01 SKOV3/neg　79.2±2.3　79.8±3.2　－1.20　0.29 SKOV3　78.2±1.2　77.7±3.3　0.47　0.66 F值48.09 P值　＜0.05

表4　2组腹腔移植瘤的重量比较　n =6，g±s

表4　2组腹腔移植瘤的重量比较　n =6，g±s

组别　对照组　处理组　t值　P值SKOV3/CXCR4　3.74±0.11　2.83±0.10　13.44　0.00 SKOV3/neg　2.82±0.13　2.76±0.11　2.53　0.06 SKOV3　2.82±0.12　2.84±0.11　－0.89　0.42 F值89.03 P值　＜0.05

表5　2组腹水量比较　n =6，ml，±s

组别　对照组　处理组　t值　P值SKOV3/CXCR4　1.20±0.42　1.21±0.40　－0.50　0.64 SKOV3/neg　1.13±0.30　1.15±0.29　－2.08　0.09 SKOV3　1.27±0.38　1.32±0.36　－2.22　0.08 F值0.22 P值　＞0.01

3讨论

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，病死率居女性生殖道恶性肿瘤之首。与其他多种类型的癌不同，卵巢癌的主要转移途径不是通过血管，而是腹腔转移，由于在腹腔的广泛种植和转移常常引起严重腹水和肠梗阻，所以卵巢癌的腹腔转移是直接引起患者死亡的主要原因。因此深入了解卵巢癌腹腔转移的机制十分重要。

腹腔微环境是影响卵巢癌转移方式的重要因素，腹腔微环境中含有许多细胞因子，包括CXCL12及其受体CXCR4、溶血磷脂酸(lysophosphatidic，LPA)及其受体及腹膜间皮细胞等，其中趋化因子CXCL12即基质细胞衍生因子1(strmal cell derived factor-1，SDF-1)，与其趋化因子受体CXCR4在介导恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要作用。Jiang等［2］首次采用免疫组化的方法分析CXCR4蛋白在正常卵巢表面上皮和卵巢上皮性癌组织的定位表达，发现CXCL12和CXCR4蛋白在卵巢上皮性癌起源的正常卵巢表面上皮无表达，而共表达在卵巢皮质的卵泡细胞。在良性和交界性上皮性卵巢肿瘤中CXCR4蛋白阳性表达率为88%和90%，均为细胞核着色; CXCL12蛋白阳性表达率100%和88%，均为细胞质着色。在卵巢恶性上皮性癌原发灶中癌细胞的CXCR4的阳性率为59%，大多数为细胞质着色; CXCL12蛋白阳性率则为91%。我们前期的体外实验发现CXCL12单独作用可促进SKOV3/CXCR4细胞的增殖、迁移及侵袭，这与Scotton等［6，7］报道相一致。

本研究结果显示3组裸鼠生存时间、腹腔移植瘤的个数和重量比较差异有统计学意义(P＜0.05)，CXCL12浓度越高，受试裸鼠腹腔移植瘤个数越多，重量越大，生存时间越短，而且CXCL12的作用依赖于CXCR4的存在，CXCR4拮抗剂可以控制肿瘤生长，这从体内动物实验水平进一步说明CXCL12-CXCR4生物轴与卵巢癌的发生发展密切相关。近期，有研究表明高CXCL12的表达的卵巢癌患者较地表达的卵巢癌患者有很低的生存，所以建议高表达的卵巢癌患者应该使用抗CXCL12-CXCR4治疗［8］。这与我们的研究一致。同时也有越来越多的关于卵巢上皮癌与CXCL12-CXCR4生物轴关系的实验在报道［9］，希望CXCL12-CXCR4生物轴对卵巢癌的临床治疗有更多的指导意义。

总之，CXCL12-CXCR4生物轴在实验水平与卵巢癌的发生、增殖、转移密切相关，它不仅可作为肿瘤转移的预测指标及预后因素，而且已成为肿瘤治疗的新方向，干扰CXCL12-CXCR4生物轴有可能成为治疗卵巢癌的一个有意义的分子靶点。

参考文献

1 Kijima T，Maulik G，Ma PC，et al.Regulation of cellular proliferarion，cytoskeletal function，and signal transduction through CXCR4 anf c-Kit in small cell lung cancer cells.Cancer Res，2002，62: 6304-6311.

2 Jiang YP，Wu XH，Shi B，et al.Expression of chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 in human epithelial ovarian cancer: an independent prognostic factor for tumor progression.Gynecol Oncol，2006，103: 226-233.

3 郭清，吉向丽，吴小华，等.稳定表达趋化因子受体CXCR4卵巢癌细胞株的建立与鉴定.第四军医大学学报，2008，23: 2148-2151.

4 Müller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature，2001，410: 50-56.

5 Singh B，Cook KR，Martin C，et al.Evaluation of a CXCR4 antagonist in a xenograft mouse model of inflammatory breast cancer.Clin Exp Metastasis，2010，27: 2333-2340.

6 Scotton CJ，Wilson JL，Milliken D，et al.Epithelial cancer cell migration: a role for chemokine receptors? Cancer Res，2001，61: 4961-4965.

7 Balkwill F.TNF-alpha in promotion and progression of cancer.Cancer Metastasis Rev，2006，25: 409-416.

8 Popple A，Durrant LG，Spendlove I，et al.The chemokine，CXCL12，is an independent predictor of poor survival in ovarian cancer.Br J Cancer，2012，106: 1306-1313.

9 蒋玉萍，吴小华，邢邯英，等.趋化因子CXCL12及其受体CXCR4对卵巢上皮性癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响.中华妇产科杂志，2007，42: 403-406.

Experimental study on the correlation between chemokine-CXCL12-CXCR4 and ovarian cancer in nude mice

GUOQing，WU Xiaohua，TAN Lixia，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology，The First Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 05001，China

【Abstract】Objective To investigate the correlation between chemokine－CXCL12-CXCR4 and the pathogenesis of ovarian cancer.MethodsThe three kinds of ovarian cancer cells including SKOV3/CXCR4 transfected with plasmid，SKOV3/neg transfected with vector and SKOV3 which was not transfected were cultured in vitro.The 36 nude mice were randomly divided into three groups (12 mice in each group)，and the peritoneal cavity transplanted tumor models in nude mice were established by intraperitoneal injection with the three kinds of ovarian cancer cells.Then the model mice in each group were subdivided into two groups on the second day after ovarian cancer cell inoculation: treatment group (n =6)，control group (n =6).The mice in control group were intraperitoneally injected with 0.9% sodium chloride solution，however，the mice in treatment group were intraperitoneally injected with CXCL12-CXCR4 antagonist－AMD3100.The transplanted tumor number and size in peritoneal cavity，ascites volume and mean survival time were observed after these mice died naturally.Results There were significant differences in body weight differences about 1 week after ovarian cancer cell inoculation between control groups and treatment groups (P＜0.05).There was a significant difference in mean survival time between SKOV3/CXCR4 control group and treatment group (CXCR4 antagonist－AMD3100)(Z =－2.29，P＜0.05)，however，there was no significant difference in mean survival time between SKOV3/neg control group and treatment group (P＞0.05)，nor was between SKOV3 control group and treatment group (P＞0.05).There were significant differences in transplanted tumor mean number and weight in peritoneal cavity between SKOV3/CXCR4 control group and treatment group (P＜0.05).Conclusion There is a correlation between chemokine-CXCL12-CXCR4 and pathogenesis of ovarian cancer，which may be one of main reasons in the pathogenesis of ovarian cancer，and may also reflect the degree of pathogenetic condition to some extent.

【Key words】CXCL12; CXCR4; ovarian tumor

(收稿日期:2013－07－18)

通讯作者:吴小华，050082中国人民解放军白求恩国际和平医院妇产科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.001

【文章编号】1002－7386(2015)06－0805－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 737.31