唑尼沙胺对癫痫大鼠脑组织NO含量的影响及相关性研究

陈芳　王丽辉　刘斌　张静　王薇　孙素真

作者单位: 050031石家庄市，河北省儿童医院神经内科

唑尼沙胺对癫痫大鼠脑组织NO含量的影响及相关性研究

陈芳王丽辉刘斌张静王薇孙素真

作者单位: 050031石家庄市，河北省儿童医院神经内科

【摘要】目的探讨新型抗癫痫药物唑尼沙胺的作用机制。方法将50只戊四氮致痫大鼠随机抽取8只为正常对照组，余42只造模成功后，随机抽取24只作为实验动物，随机分为唑尼沙胺组、苯巴比妥组和癫痫模型组，每组8只。监测4组大鼠唑脑组织NO、MDA含量及NOS、SOD的活性变化并观察大鼠海马组织结构的改变。结果癫痫组大鼠脑组织NO、MDA含量及NOS活性与正常对照组比较明显增高(P＜0.05)，SOD活性明显降低(P＜0.05);唑尼沙胺组及苯巴比妥组大鼠脑组织的NO、MDA含量及NOS活性与癫痫组比较明显降低(P＜0.05)，SOD活性明显升高(P＜0.05);唑尼沙胺能够改善癫痫大鼠海马组织的结构。结论唑尼沙胺通过降低脑组织NO含量而发挥其抗癫痫作用。

【关键词】唑尼沙胺;戊四氮;癫痫;一氧化氮;海马

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癫痫作为一种特殊的中枢神经系统疾病，人们一直在探寻其治疗方法。近年来，国内外众多学者对NO在癫痫的发病机制中起作用进行研究，并证实其致痫性。为此，我们以戊四氮致痫大鼠作为研究对象，分析各组大鼠脑组织NO含量的变化，探索新型抗癫痫药物唑尼沙胺的抗癫痫机制，为癫痫治疗提供新的思路。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠50只，体重(250 ±20)g(许可证号: 1310073河北医科大学实验动物中心提供)。实验前先将所有动物在实验室饲养7 d，以适应环境。从所有实验动物中随机抽取8只为正常对照组，剩余42只全部腹腔注射戊四氮制成癫痫模型。在成功的癫痫模型中随机抽取24只作为本实验动物，随机分为唑尼沙胺组、苯巴比妥组和癫痫模型组，每组8只。

1.2方法

1.2.1模型制作:所有致痫大鼠均给予戊四氮溶液45 mg/kg，每24小时腹腔注射1次，注射后均观察40 min，观察、记录致痫大鼠发作的潜伏期、惊厥发作的表现及持续时间。致痫大鼠的癫痫表现形式采用Racine分级评价标准: 0级，无反应;Ⅰ级，湿狗样抖动和(或)面肌痉挛，如动须、眨眼及节律性咀嚼;Ⅱ级，颈部肌肉的痉挛，出现点头和(或)甩尾;Ⅲ级，单侧前肢痉挛;Ⅳ级，双侧前肢痉挛，站立位出现;Ⅴ级，全身强直、阵挛，失去平衡、跌倒。观察实验大鼠在造模过程中出现以上分级中的Ⅳ～Ⅴ级表现，提示戊四氮点燃成功。正常对照组在同期给予同等容量的0.9%氯化钠溶液腹腔注射。

1.2.2脑电图监测:从每组实验大鼠中抽取2只行脑电图监测:先用10%的水合氯醛35 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠后参照王净净等［1］方法固定于固定架上。再用头皮针样电极的单极导联法［2］，连续描记2 min的脑电图。脑电图灵敏度20 μV/mm，时间常数为0.1 s。每次记录前均在彩色显示器上观察信号，待信号基线平稳后再将信号存入计算机硬盘。放置电极位置及导联:单极导联法;取2根0.5寸针灸毫针为记录电极分别刺入大鼠头顶部中线两侧的头皮下，再将导线连接到脑电图的信号输入设备，大鼠尾根部也需要电极的放置，接地。在每只大鼠的第6次癫痫发作时描记脑电图，先观察行为学变化，再记录脑电图变化。

1.2.3药物剂量及途径:造模成功后0.5 h，唑尼沙胺组给予唑尼沙胺45 mg·kg－1·d－1灌胃;苯巴比妥组给予苯巴比妥35 mg·kg－1·d－1灌胃;正常对照组、癫痫组给予同等体积的0.9%氯化钠溶液。1次/d，于11∶00前给药，连续给药14 d。

1.2.4标本的采集:所有动物在试验2周时称重后，首先将大鼠以戊巴比妥钠40 mg·kg－1·d－1腹腔注射麻醉后，仰卧位固定在大鼠手术板上。断头取出整块的脑组织。用吸水纸粘去多余水分，将脑组织称重，取一侧大脑半球经甲醛固定后行病理切片观察;另一侧大脑用0.9%氯化钠溶液按1 g∶9 ml比例制成10%的脑组织匀浆，取上清液，冰冻－70℃待测。

1.2.5标本的测定:将脑组织上清液从冰箱取出后常温融化后按照各试剂盒说明书操作步骤进行检测;

1.2.6病理学观察:将HE染色的海马组织切片置于光镜下观察。每只动物均取2张组织切片，每张切片均按由CA1、CA2、CA3、CA4的顺序随机观察5个不重复视野，观察实验动物海马组织的神经元形态和数目分布。

1.3统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以±s表示，先行正态性检验，服从正态分布的资料，方差齐性检验后，多组间比较采用单因素方差分析检验，2组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1癫痫大鼠的特征共给42只SD大鼠注射戊四氮，其中有2只大鼠有Ⅴ级发作持续10 min以上而死亡，占戊四氮致痫大鼠的4.8%。所有大鼠均在第1次腹腔注射戊四氮后出现Ⅲ级及以上惊厥发作，表现为点头、前肢痉挛性抽动及点头等症状。随着实验的进行，致痫大鼠的发作症状逐日加重。其中90%的实验动物可在第2次注射戊四氮后，表现出双侧前肢抬起和(或)阵挛性抽动，甚至直立位;提示致痫大鼠的发作级别已经达到RacineⅣ级及以上。第3次戊四氮腹腔注射后，5只未达RacineⅣ级发作。最终35只大鼠点燃成功，占所有致痫大鼠的83%。正常对照组腹腔注射0.9%氯化钠溶液14 d，无癫痫发作;癫痫模型组腹腔注射每日腹腔注射戊四氮维持癫痫发作。其癫痫发作在戊四氮腹腔注射3～5 min开始出现，首先表现为凝视不动、咀嚼、吸鼻，提示癫痫行为Racine分级Ⅰ～Ⅱ级，持续5 min出现反复的咀嚼、面部抽搐及前肢抖动、后退、站立跌倒和旋转等，提示Racine癫痫行为分级Ⅲ～Ⅳ级，发作间期逐渐缩短，发作期逐渐延长;唑尼沙胺组及苯巴比妥组大鼠发作级别降低、潜伏期延长，持续时间缩短，具有一定抗癫痫作用。但观察唑尼沙胺与苯巴比妥相比较起效慢，给药4 d后2组大鼠在癫痫发作频率及发作持续时间上无明显区别。

2.2脑电图改变正常对照组的脑电图表现为低中幅、相对对称的正常脑电波。戊四氮致痫大鼠脑电图表现为:基本背景节律下可见阵发性癫痫波。唑尼沙胺组及苯巴比妥组大鼠经过药物干预，脑电波中的棘波减少，背景节律较规整。

2.34组大鼠脑组织NO含量及NOS活性的变化癫痫模型组大鼠经腹腔注射戊四氮14 d后，测定NO的含量及NOS活性明显升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);唑尼沙胺组和苯巴比妥组与癫痫模型组大鼠比较，其NO含量及NOS活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1　4组大鼠脑组织NO含量及NOS活性比较n =8±s

表1　4组大鼠脑组织NO含量及NOS活性比较n =8±s

注:与正常对照组比较，*P＜0.05;与癫痫组比较，#P＜0.05

组别　NO(μmol/g)　NOS(U/mg)正常对照组4.01±0.25　0.21±0.02癫痫模型组　11.79±1.03*　0.58±0.05*唑尼沙胺组　7.72±0.92#　0.34±0.05#苯巴比妥组　6.28±0.44#　0.26±0.02#

2.44组大鼠脑组织MDA含量、SOD活性的变化癫痫模型组造模成功后，MDA含量明显升高，SOD含量明显减少，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);唑尼沙胺组和苯巴比妥组与癫痫模型组大鼠比较，其脑组织的MDA明显减少，SOD含量明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05 )。见表2。

2.5病理正常对照组大鼠海马CA3区神经元排列密集、规则，脑组织未见明显损害。而癫痫组海马神经元排列紊乱、疏松，可见脑组织坏死性改变，以海马CA1、CA3区明显;表现神经元变性和固缩性坏死。变性的神经元肿胀，体积增大。有典型的多角型变为圆

表2　4组大鼠MDA含量和SOD活性水平比较n =8±s

表2　4组大鼠MDA含量和SOD活性水平比较n =8±s

注:与正常对照组比较，*P＜0.05;与癫痫模型组比较，#P＜0.05

组别　MDA(nmol/mg)　SOD(U/mg)正常对照组4.3±0.5　53.6±2.5癫痫模型组　15.0±1.4*　23.0±1.9*唑尼沙胺组　9.5±1.2#　33.9±2.7#苯巴比妥组　7.3±0.7#　38.8±3.5#

形或三角形，胞体偏位;坏死的神经元胞浆浓缩，深染，核仁不明显，核固缩、核破裂。唑尼沙胺组及苯巴比妥组大鼠海马神经元经药物干预均较癫痫组神经元排列整齐、密集，细胞形态规则。见图1。

图1　4组大鼠海马病理(HE×10)

3　讨论

癫痫作为一种长期反复发作的慢性神经系统疾病，人们对癫痫发病机制及治疗的研究，主要依靠动物模型。戊四氮作为一种兴奋中枢神经系统的药物，根据其药代动力学特点，此药物可以引起动物抽搐的迅速发生。并且这种抽搐发作可以迅速达到高峰，持续较短，能自动停止，同时此模型具有不破坏局部脑组织的结构，不伴有神经元损伤、坏死的优点［3］，有利于癫痫脑组织形态学的观察。因此戊四氮致痫的动物模型是研究癫痫的理想动物模型［4］。

目前治疗癫痫的基本方法仍是口服抗癫痫药物。传统的抗癫痫药物如苯妥英、卡马西平、丙戊酸等均因长期服用出现较大的毒性，并且可能存在肝酶代谢异常、半衰期短及产生活性代谢产物等，其副作用较严重，所以在临床上的应用受到限制［5］。唑尼沙胺是一种新型广谱抗癫痫药，无传统大多数AEDs所含有的酰腺结构，具有独特的化学结构和广谱的抗癫痫活性［6］。唑尼沙胺作为在难治性部分性发作的癫痫患者添加治疗及单药已显示出其有效性［7，8］，长期治疗也持续有效［9，10］，且相对于传统抗癫痫药物副作用小。已发现此药物可通过多种作用机制发挥治疗癫痫的作用，主要包括: (1)抑制电压依赖性钠离子通道; (2)降低T-型钙离子内流［11］; (3)直接改变一些神经递质的合成、释放和降解，如GABA、多巴胺、5-HT和乙酰胆碱，这些作用可以增强突触抑制。但是，NO及氧自由基在唑尼沙胺抗癫痫作用机制中的作用，笔者尚未见有报道。

本实验通过监测脑组织NO含量、NOS活性，证实了癫痫发作后NO含量升高，引起海马组织损伤;经过唑尼沙胺及苯巴比妥治疗后海马损害程度减轻，且脑组织NO含量及NOS活性降低，提示唑尼沙胺可能通过降低脑组织NO含量或NOS活性而发挥其抗癫痫的作用。另外，本实验中癫痫组大鼠脑组织MDA含量升高，SOD活性降低;而经过唑尼沙胺干预治疗的大鼠与癫痫组大鼠相比较，MDA含量降低，SOD活性升高，大鼠海马组织细胞排列紧密、规整，提示唑尼沙胺可能通过降低脑组织MDA含量或提高SOD活性起到其神经保护作用。通过本实验证实了唑尼沙胺的抗癫痫治疗的有效性，并为我们临床工作中寻找新的抗癫痫药物及选用合理的抗癫痫药物提供借鉴。

参考文献

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Effect of zonisamide on NO content in brain tissue of rats with epilepsy

CHEN Fang，WANG Lihui，LIU Bin，et al.
Department of Neurology，Hebei Provincial Children’s Hospital，Shijiazhuang 050031，China

【Abstract】Objective To investigate the action mechanism of zonisamide as a new antiepileptic drug.Methods Twenty-four rats with epilepsy induced by pentrazol were randomly divided into three groups: zonisamide group，phenobarbital group，epilepsy model group，with 8 rats in each group，at same time，the other 8 normal rats were used as control group.The contents of NO，MDA and activities of NOS，SOD in brain tissues of the rats were detected for the four groups，meanwhile，the changes of hippocampus tissue structure of the rats were observed.Results The contents of NO，MDA and activity of NOS were significantly increased in epilepsy model group，as compared with those in control group (P＜0.05)，however，the activity of SOD was significantly decreased in epilepsy model group (P＜0.05).The contents of NO，MDA and activity of NOS were significantly decreased in zonisamide group and phenobarbital group，as compared with those in epilepsy model group，however，the activity of SOD was significantly increased in both groups (P＜0.05).Furthermore，zonisamide could improve the structure of hippocampus tissue in rats with epilepsy.ConclusionZonisamide plays an antiepileptic role by reducing the contents of NO in rats with epilepsy.

【Key words】zonisamide; pentrazol; epilepsy; NO; hippocampus

(收稿日期:2014－10－15)

通讯作者:王丽辉，050031石家庄市，河北省儿童医院神经内科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.003

【文章编号】1002－7386(2015)06－0812－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 971.6