口腔鳞癌组织中Slug表达及意义

陈友兴，冯红超，宋宇峰，舒敏(贵阳医学院，贵阳550004;贵阳市口腔医院;贵州省食品药品监督局)

口腔鳞癌组织中Slug表达及意义

陈友兴1，冯红超2，宋宇峰3，舒敏1
(1贵阳医学院，贵阳550004;2贵阳市口腔医院;3贵州省食品药品监督局)

摘要:目的观察锌指转录因子(Slug)在口腔鳞癌(OSCC)组织中的表达变化，分析其与上皮间质转化(EMT)特征性蛋白E-钙黏蛋白(E-cad)和波形蛋白(Vimentin)的关系，探讨Slug在EMT中的作用。方法采用免疫组织化学法和原位杂交法检测42例OSCC组织(观察组)及12例正常口腔黏膜组织(对照组)中Slug、E-cad、Vimentin的表达，比较Slug在两组中表达的差异性，分析Slug与E-cad及Vimentin的相关性、Slug与OSCC临床病理因素的相关性。结果观察组Slug的阳性表达率明显高于对照组(P＜0.01) ; Slug在OSCC组织中的表达与淋巴结转移、肿瘤病理分级有关(P均＜0.05)，与OSCC发病年龄无关; Slug与E-cad的表达呈负相关(r=－3.19，P＜0.05)，Slug与Vimentin的表达呈正相关(r=0.264，P＜0.05)。结论OSCC组织中Slug表达明显上调，并与E-cad、Vimentin具有相关性，在EMT中具有重要作用，参与了OSCC的发生、分化及转移过程。

关键词:口腔鳞癌;锌指转录因子;上皮间质转化;免疫组织化学;原位杂交

口腔鳞癌(OSCC)是一种宿主易感性与多病因相互作用的一种多过程疾病，与烟草、乙醇、咀嚼槟榔及存在其他呼吸道癌和消化道癌等有关［1］。在恶性肿瘤的发展进程中，上皮间质转化(EMT)机制起关键作用。EMT能够使具有极性的上皮细胞转换为具有移行能力的间质细胞，并获得高侵袭性和转移的能力［2］。锌指转录因子(Slug)是Snail家族成员，是EMT的重要调节因子，其表达往往提示患者预后较差［3］。E-钙黏蛋白(E-cad)和波形蛋白(Vimentin)是EMT的特征性蛋白，二者的表达呈负相关。本研究从蛋白质和mRNA水平检测OSCC组织中Slug的表达，分析Slug的表达与临床病理因素及E-cad、Vimentin表达的关系，探讨Slug因子在EMT中的作用。

1　资料与方法

1.1临床资料收集2008～2014年贵阳医学院附属医院及贵阳市口腔医院收治的OSCC患者42例(观察组)，其中男25例、女17例，年龄33～78岁、平均59.3岁。均经手术病理检查证实，术前未行放化疗、内分泌及生物治疗。临床分期Ⅰ期7例，Ⅱ期8例，Ⅲ期19、Ⅳ期8例;分化程度:高分化26例，中低分化16例;伴淋巴结转移23例。另外选择无烟酒嗜好的外伤或正畸拔牙患者12例作为对照(对照组)，其性别、年龄与观察组具有可比性。

1.2Slug蛋白、E-cad、Vimentin检测采用免疫组织化学法。取观察组手术切除的肿瘤组织和对照组正常口腔黏膜组织，10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，柠檬酸高压热修复，加入一抗，4℃过夜，PBS浸洗，加入二抗37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。用已知阳性的卵巢癌切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。兔抗人Slug单克隆抗体购自博奥森生物(浓度1∶150)，鼠抗人E-cad/vimentin单克隆抗体(浓度1∶100)、二抗免疫组化试剂盒购自北京中杉公司。

1.3Slug mRNA检测采用原位杂交法。石蜡切片复温、常规脱蜡至水。3% H2O2室温作用10 min，蒸馏水洗3次，胃蛋白酶室温消化，暴露mRNA核酸片段，加入固定液室温固定10 min;蒸馏水洗3次，滴加预杂交液，湿盒放入40℃恒温箱中4 h，滴加杂交液，38～42℃恒温箱过夜，依次用37℃预温的2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC冲洗，滴加封闭液，37℃孵育30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃孵育60 min，滴加生物素过氧化物酶，37℃孵育20 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替杂交液作为阴性对照。

1.4结果判定

1.4.1人工计分法光学显微镜下观察免疫组化和原位杂交后组织标本的着色程度。Slug蛋白阳性信号为棕黄色颗粒，定位于细胞核，细胞质中也有表达，Slug mRNA主要表达于细胞质，着色为棕黄色; Vimentin阳性信号定位于胞质内，呈清晰棕黄色颗粒。E-cadherin蛋白阳性染色主要定位于细胞膜，于肿瘤细胞质或细胞核表达＞10%，称为异位表达;不表达或细胞膜表达＜10%称为细胞膜表达缺失。异位表达和细胞膜表达缺失统称为阳性表达，单纯细胞膜表达定义为阴性表达。每例切片随机选择5个高倍视野，分别按照阳性细胞百分比计分和染色强度计分，阳性细胞数1～25%为1分，26%～50% 为2分，51%～75%为4分，＞75%为4分;无着色为0分，弱阳性为1分，强阳性为2分。以阳性细胞数积分乘以染色强度积分，乘积≥3分为阳性，＜3分为阴性。

1.4.2图像分析法取免疫组织化学和原位杂交法染色的切片，随机选取5个阳性视野，用Imagepro-plus6.0图像分析系统分别检测阳性细胞的积分光密度和感兴趣区域(AOI)面积，计算平均光密度值。

1.5统计学方法采用SPSS19.0统计软件，计数资料比较采用四格表χ2或FISH法检验，组间比较采用配对t或t'检验;相关性分析采用Spearman等级相关系数分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组Slug、E-cad、Vimentin表达情况Slug蛋白:观察组阳性29例(69.0%)，明显高于对照组的3例(25.0%)，P＜0.01。E-cad:观察组阳性18例(42.9%)，明显低于对照组的12例(100%)，P＜0.01。Vimentin:观察组阳性30例(71.4%)，明显高于对照组的2例(16.7%)，P＜0.05; Slug mRNA:观察组阳性25例(59.5%)，明显高于对照组的1 例(8.3%)，P＜0.05。

2.2两组Slug、E-cad、Vimentin平均光密度值观察组Slug和Vimentin的平均光密度值均高于对照组，E-cad低于对照组(P均＜0.05)。见表1。

表1　两组Slug、E-cad、Vimentin平均光密度值比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05。

组别　n Slug　E-cadherin　Vimentin观察组　42　0.264±0.083*0.187±0.048*0.210±0.055*对照组12　0.204±0.026　0.265±0.082　0.161±0.009

2.3OSCC组织中E-cad与Slug表达的关系相关性分析显示，E-cad与Slug在OSCC中的表达呈负相关(r=－3.19，P＜0.05)，Vimentin与Slug的表达呈正相关(r=0.264，P＜0.05)。

2.4Slug的表达与OSCC临床病理因素的关系OSCC组织中Slug的表达与其淋巴结转移、肿瘤分化程度有关(P＜0.05)，与OSCC发病年龄无关。见表2。

3　讨论

研究发现，Slug作为一种抗凋亡剂，参与对乳腺癌局部浸润的维护，使肿瘤得以生长，并对放疗产生失敏感性［4］。对人类胚胎干细胞进行体外分化实验发现，Slug能够抑制E-cad表达，促进Vimentin和基质金属蛋白酶增加［5］，这与上皮源性的肿瘤转移机制类似。本研究采用免疫组化方法观察观察组中Slug的表达变化，结果显示，其阳性表达率为78.6% (29/42)，明显高于对照组，与原位杂交法所得mRNA的表达变化一致。Slug主要定位于肿瘤细胞的细胞核，在少量唾液腺导管上皮中也可见阳性表达，说明在OSCC组织中，Slug可能主要由肿瘤细胞、导管上皮细胞等分泌产生，与肿瘤发生、发展及转移过程中某些生物学行为的调节有关。本研究显示，Slug在观察组中的表达明显高于对照组，并且与肿瘤的病理分级和淋巴结转移有关。

EMT是肿瘤转移的重要机制之一，它是一个高度保守的过程，能够使静止的上皮细胞极性消失，失去紧密连接，突破基底膜，成为具有迁移能力的间充质细胞，在上皮源性癌的空间转移过程中具有重要作用［6］。E-cad是EMT重要的标志蛋白，研究显示，E-cad表达与OSCC的组织学分级显著相关，提示E-cad作为一个结构性的关联，在肿瘤进展中发挥重要作用［7］。Vimentin是所有中间纤维分布最广的蛋白质，在正常的间充质细胞中广泛表达，具有维持细胞完整性和抗应力的作用。E-cad与Vimentin是EMT的特征性蛋白，二者表达呈负相关［8］。Vimentin在各种上皮性癌中都有表达，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌等［9～11］，其过表达与肿瘤的生长、侵袭密切相关。本研究显示，Slug与E-cad、Vimentin分别呈负相关和正相关关系，表明Slug一定程度上参与了EMT的过程，其可能通过上调肿瘤的侵袭和转移能力，使之容易出现远处转移。肿瘤转移是一个复杂的过程，肿瘤细胞从原发灶脱离并向远处定植这一过程是通过局部浸润、血行转移、细胞增殖等步骤来实现的［12］。在OSCC的发生发展中，Slug的表达与E-cadherin、Vimentin具有一定的相关性，在EMT中具有重要作用，其具体机制有待进一步研究。

参考文献:

［1］赵世禄，程福强，史繁华.口腔鳞状细胞癌临床流行病学研究现状［J］.2013(04) : 1648-49.

［2］Lee JM，Dedhar S，Kalluri R，et al.The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling，development，and disease ［J］.Cell Biol，2006，172(7) : 973-981.

［3］Merikallio H，T TT，Päkkitaro P，et al.Slug is associated with poor survival in squamous cell carcinoma of the lung［J］.Clin Exp Pathol，2014，7(9) : 5846-5854.

［4］Còme C，Arnoux V，Bibeau F，et al.Roles of the transcription factors snail and slug during mammary morphogenesis and breast carcinoma progression［J］.Mammary Gland Biol Neoplasia，2004，9 (2) : 183-193.

［5］Eastham AM，Spencer H，Soncin F，et al.Epithelial-mesenchymal transition events during human embryonic stem cell differentiation［J］.Cancer Res，2007，67(23) : 11254-11262.

［6］Ombrato L，Malanchi I.The EMT universe: space between cancer cell dissemination and metastasis initiation［J］.Crit Rev Oncog，2014，19(5) : 349-361.

［7］Zaid KW.Immunohistochemical Assessment of E-cadherin and βcatenin in the Histological Differentiations of Oral Squamous Cell Carcinoma［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(20) : 8847-8853.

［8］Havel LS，Kline ER，Salgueiro AM，et al.Vimentin regulates lung cancer cell adhesion through a VAV2-Rac1 pathway to control focal adhesion kinase activity［J］.Oncogene，2015，34(15) :1979-1990.

［9］Burch TC，Watson MT，Nyalwidhe JO，et al.Variable metastatic potentials correlate with differential plectin and vimentin expression in syngeneic androgen independent prostate cancer cells［J］.PLoS One，2013，8(5) : 65005.

［10］Baldwin LA，Hoff JT，Lefringhouse J，et al.CD151-α3β1 integrin complexes suppress ovarian tumor growth by repressing slug-mediated EMT and canonical Wnt signaling［J］.Oncotarget，2014，5 (23) : 12203-12217.

［11］Kim KH，Kim L，Choi S，et al.The clinicopathological significance of epithelial mesenchymal transition associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Korean J Pathol，2014，48(4) : 263-269.

［12］廖子君，雷光焰.肿瘤转移学［M］.陕西:陕西科学技术出版社，2007: 14-18.

(收稿日期:2014-12-07)

通信作者:冯红超

基金项目:贵阳市卫生局科技计划项目［筑卫科技合同字(2014)第15号］。

文章编号:1002-266X(2015)18-0070-03

文献标志码:B

中图分类号:R739.8

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.026